độ cao bằng phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mơ phịng thí nghiệm
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ khả năng biểu hiện vượt mức
protein dung hợp 6xHis-MPI ở dạng thể vùi trong tế bào chất. Do vậy lượng 6xHis-MPI tỷ lệ thuận với lượng sinh khối thu được trong quá trình lên men cảm
ứng biểu hiện. Nhằm thu nhận được lượng lớn sinh khối tế bào chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins với chi phí thấp nhất, chúng tơi chọn phương án nuơi cấy mẻ –bổ sung mật độ cao với mơi trường cĩ thành phần đơn giản, rẻ tiền.
Để đạt được mục tiêu này, chúng tơi tiến hành khảo sát các thành phần mơi trường nuơi cấy khác nhau (Bảng 2.2), khảo sát phương án nạp Mơi trường bổ sung và các điều kiện nuơi cấy thích hợp nhất. Các thí nghiệm được thực hiện trên hệ thống lên men mini-jar 5 lít (Biotron) với 2,5 L mơi trường ban đầu và 2,0 L Mơi trường bổ sung, tỷ lệ nạp giống là 5%. Độ ơxi hịa tan được duy trì ở mức >30% bảo hịa bằng cách khuấy trộn (200 vịng/phút) và sục khí 1 Vvm với điều kiện nuơi cấy và cảm ứng tối ưu theo các điều kiện đã xác định được trong
phần 2.4.6. Trong quá trình nuơi cấy, tiến hành thu mẫu 2 giờ/lần để khảo sát
động học tăng trưởng thơng qua trị số OD600nm, chỉ số trọng lượng tế bào khơ
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
dinh dưỡng thích hợp. Khi quá trình lên men kết thúc, tiến hành thu mẫu để phân tích đánh giá mức độ biểu hiện 6xHis-MPI của chủng.
Khi nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy cạn kiệt (được nhận biết khi pH và DOC tăng lên trong quá trình nuơi cấy), tiến hành nạp Mơi trường bổ sung liên tục theo phương pháp tăng từng bước. Phương án nạp bổ sung mơi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men dựa trên nguyên tắc là việc bổ sung mơi trường phải đáp ứng nhu cầu vừa đủ của vi sinh vật để cĩ tốc độ tăng trưởng cao nhất và biểu hiện được protein mục tiêu tốt nhất. Dựa trên thơng tin các tài liệu tham khảo của Shin và cộng sự (1997) [59], chúng tơi tính tốn tốc độ nạp Mơi trường bổ sung như sau:
F = Yx/s So t V Xo × × × × × μ exp(μ )
Trong đĩ, F là tốc độ bổ sung Mơi trường bổ sung (ml/giờ); Xo là hàm
lượng sinh khối tại thời điểm bắt đầu nạp Mơi trường bổ sung (g/L); V là thể tích
dịch nuơi cấy tại thời điểm nạp Mơi trường bổ sung; μ là tốc độ tăng trưởng đặc
trưng (1/giờ), So là nồng độ cơ chất trong Mơi trường bổ sung (g/ml); Yx/s là hiệu suất sinh tổng hợp sinh khối tính theo cơ chất S; t là thời gian nuơi cấy.
Cài đặt các thơng số trong hệ thống lên men để bảo đảm chế độ nạp Mơi trường bổ sung tự động như mong muốn. Khi nạp được khoảng 80% thể tích Mơi trường bổ sung, tiến hành cảm ứng bằng IPTG. Lượng Mơi trường bổ sung cịn lại sẽ được nạp đều liên tục trong thời gian cảm ứng.