đồng với insulin chuẩn bằng phương pháp RP-HPLC.
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA ELISA
Phương pháp ELISA gián tiếp với kháng thể đơn dịng OXI-005 cĩ khả năng nhận diện và gắn lên epitope lập thể trên MPI tái gấp cuộn được sử dụng để đánh giá hiệu quả tái gấp cuộn MPI. Kháng nguyên (MPI tái gấp cuộn hoặc insulin) được cố định lên giếng sẽ tương tác với kháng thể OXI-005 và tiếp đến kháng thể này được phát hiện nhờ kháng thể kháng Ig cộng hợp. Qui trình ELISA gián tiếp được thực hiện qua các bước:
- Cố định kháng nguyên: Để đảm bảo nguyên vẹn cấu trúc khơng gian của MPI hoặc insulin, kháng nguyên thử nghiệm được cố định trên giếng trong
dung dịch PBST, pH 7,2 với lượng 250 ng protein/giếng, ủ 37oC trong 2 giờ.
- Khĩa màng: Các vị trí cịn trống trên giếng khơng cĩ insulin được phong
tỏa. Bổ sung 100 μl dung dịch blocking 5% (sữa gầy) vào tất cả các giếng, ủ
25oC trong 1 giờ, rửa bằng dung dịch PBST.
- Ủ với kháng thể OXI-005: kháng thể sử dụng với lượng 250 ng cho mỗi giếng được pha lỗng trong dung dịch serum lỗng; Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng; Rửa bằng dung dịch PBST.
- Ủ với kháng thể thứ cấp: bổ sung 100μl/giếng kháng thể kháng Ig (anti-
Ig) chuột đánh dấu HRP pha lỗng 1/10.000 vào tất cả các giếng; Ủ trong 1 giờ ở
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
- Đọc kết quả: cơ chất của HRP là dung dịch OPD-H2O2 được bổ sung vào
tất cả các giếng (100 μl/giếng). Ủ trong tối ở nhiệt độ phịng khoảng 30 phút sau
đĩ bổ sung H2SO4 2N để dừng phản ứng tạo màu. Đo cường độ màu ở bước sĩng
492nm bằng máy Multiskan Ascent. Kết quả OD492nm của 2 giếng cùng điều kiện
(A, B) được tính trung bình cộng [11].