BL21(DE3)/pET43Ins
Nhằm xác định các điều kiện tối ưu để tổng hợp 6xHis-MPI từ chủng E.
coli BL21(DE3)/pET43Ins, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng
độ IPTG và thời gian cảm ứng lên sự biểu hiện 6xHis-MPI.
6xHis-MPI
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận a. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng tối ưu
Để xác định được điều kiện nhiệt độ cảm ứng tối ưu, chúng tơi tiến hành
khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau từ 25oC đến 37oC. Các bước thực hiện như đã
mơ tả trong phần Phương pháp 2.4.6. Kết quả thu nhận được trình bày trên Hình
3.12.
A B
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng biểu hiện tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Cảm ứng biểu hiện ở 25oC; 4, Cảm ứng ở nhiệt độ 30oC; 5, Cảm ứng ở nhiệt độ 35oC; 6, Cảm ứng ở nhiệt độ 37oC.
Kết quả trên Hình 3.12Acho thấy ở các giếng 3, 4, 5, 6 cĩ xuất hiện vạch
protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa được xác nhận là 6xHis-MPI (bằng phương
pháp lai Western Blot, Hình 3.12B) khi được cảm ứng bằng IPTG, trong khi đĩ ở
giếng 2 (khơng cảm ứng) khơng thấy cĩ xuất hiện vạch protein này. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện bằng phầm mềm Quantity One (Biorad) dựa vào đậm độ của vạch protein trên bản điện di SDS-PAGE cho thấy khi nuơi cấy và
cảm ứng biểu hiện chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ở các nhiệt độ khác nhau
từ 25Ỉ 35oC đều cĩ biểu hiện 6xHis-MPI tốt với mức biến động từ 15,4%-
15,9% tổng protein tế bào, ở nhiệt độ cảm ứng 37oC, mức độ biểu hiện là 14,4%.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Chúng tơi chọn điều kiện cảm ứng 30oC để tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu
về sau.
b. Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng biểu hiện tối ưu
Nồng độ chất cảm ứng IPTG cĩ vai trị quan trọng trong việc quyết định
mức độ biểu hiện protein mục tiêu của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Để
xác định được nồng độ cảm ứng biểu hiện tối ưu, chúng tơi tiến hành khảo sát bằng cách thay đổi nồng độ IPTG bổ sung vào trong giai đoạn cảm ứng. Các
bước tiến hành thí nghiệm như đã được trình bày trong phần Phương pháp 2.4.6,
với nhiệt độ cảm ứng là 30oC.Kết quả thu nhận được trình bày trên Hình 3.13.
A B
Hình 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, IPTG 0,1 mM; 4, IPTG 0,2 mM; 5, IPTG 0,3 mM; 6, IPTG 0,4 mM; 7, IPTG 0,5 mM; 8, IPTG 0,6 mM.
Kết quả điện di SDS-PAGE trên Hình 3.13 A cho thấy, khi nuơi cấy chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ cảm ứng bằng IPTG thì đều cĩ sự xuất hiện vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, được xác định là protein dung hợp
6xHis-MPI (giếng 3Ỉ 8). Trong khi đĩ, ở trường hợp khơng cĩ cảm ứng (giếng
2) thì khơng cĩ sự biểu hiện protein này. Khi tăng nồng độ chất cảm ứng IPTG 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
từ 0,1 mM lên 0,3 mM (từ giếng 3 đến giếng 5) thì mức độ biểu hiện 6xHis-MPI tương ứng cũng tăng từ 6,4% lên 9,1%. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,3 mM đến 0,6 mM thì mức độ biểu hiện vẫn khơng thay đổi, dao động ở mức từ 9,1-11,3% (giếng 6, 7, 8). Điều kiện cảm ứng 0,3 mM được chọn làm cơ sở cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau.
c. Khảo sát thời gian cảm ứng biểu hiện tối ưu
Tiến hành khảo sát thời lượng cảm ứng phù hợp nhất để thu nhận protein mục tiêu với điều kiện thực hiện như đã được mơ tả trong phần Vật liệu – Phương pháp và sử dụng các kết quả thu nhận được của các thí nghiệm nghiên cứu trước.
Hình 3.14. Kết quả khảo sát thời lượng cảm ứng tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, cảm ứng16 giờ; 4, cảm ứng 20 giờ; 5, cảm ứng 24 giờ; 6, cảm ứng 28 giờ.
Kết quả thu được trên Hình 3.14 cho thấy khi chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins được cảm ứng bằng IPTG (giếng 3, 4, 5, 6 Hình 3.14 A)
cĩ xuất hiện các vạch protein được xác nhận là 6xHis-MPI bằng phương pháp lai
Western Blot với kháng thể kháng Histidine, (Hình 3.14 B). Trong khi đĩ trên
giếng 2 (khơng cảm ứng) thì khơng cĩ vạch protein này. Ở thời lượng cảm ứng 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
16 giờ, mức độ biểu hiện 6xHis-MPI đạt 9,3%. Khi tăng thời lượng cảm ứng từ 20 giờ đến 28 giờ (giếng 4, 5, 6) thì mức độ biểu hiện cũng tăng và dao động từ 10,4-11,2%. Chúng tơi chọn thời lượng cảm ứng biểu hiện là 20 giờ làm cơ sở cho các nghiên cứu sau.
Từ các kết quả khảo sát thu được trên đây chúng tơi cĩ thể kết luận rằng
điều kiện cảm ứng tối ưu nhất cho việc tổng hợp 6xHis-MPI của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins là nhiệt độ 30oC, nồng độ IPTG 0,3mM trong thời gian 20
giờ. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhĩm tác giả Lê Văn Phủng và cộng sự khi nghiên cứu biểu hiện proinsulin trên vector pET-28a(+)
biểu hiện trong E. coli BL21(DE3) [7], tuy nhiên nồng độ IPTG cần thiết cho
cảm ứng tối ưu chỉ cần 0,3mM, nhỏ hơn trong báo cáo trên (0,4mM). Chúng tơi sử dụng các điều kiện này để nuơi cấy cảm ứng biểu hiện MPI cho các thí nghiệm về sau.
3.2.3. Xác định điều kiện nuơi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ở qui mơ phịng thí nghiệm