MPI tái tổ hợp ở qui mơ phịng thí nghiệm và qui mơ pilot 3.2.1. Hoạt hĩa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins được nuơi cấy mơi trường LB agar để
thu nhận khuẩn lạc đơn dùng để hoạt hĩa và nuơi cấy. Kết quả theo dõi động học tăng trưởng của chủng trong quá trình nhân giống được biểu diễn theo Hình
3.10. Quá trình nhân giống kết thúc sau 6,5 giờ nuơi cấy, đạt OD600nm = 1,7. Phân tích nồng độ tế bào khơ (DCW) đạt 4,9 g/L. Lúc này chủng đang ở pha tăng
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
trưởng, cĩ hoạt tính tốt nhất, dùng làm giống mầm cho các thí nghiệm về sau của
nghiên cứu này. Giống mầm được bảo quản trong tủ lạnh 4oC, sử dụng trong 1
tuần. Hiệu suất sinh tổng hợp tế bào tính trên cơ chất cao nấm men Yx/s đạt 49%
(Yx/s=4,9/10*100 = 49%). 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 0 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian nuơi cấy (giờ)
O
D
600nm
Hình 3.10. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trong mơi trường LB.
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins sau quá trình nhân giống được tiến
hành nuơi cấy để kiểm tra sự biểu hiện theo phương pháp đã trình bày trong mục
2.4.4. Kết quả kiểm tra biểu hiện theo phương pháp điện di SDS-PAGE và xác
nhận sự biểu hiện bằng phương pháp Western Blot được trình bày trên Hình 3.11.
Kết quả trên Hình 3.11 A cho thấy thấy ở giếng 3 cĩ xuất hiện một vạch kích
thước khoảng 9 kDa, tương ứng với kích thước của 6xHis-MPI trong khi đĩ ở chứng âm (giếng 2) khơng thấy xuất hiện vạch protein này. Kết quả xác nhận protein biểu hiện bằng phương pháp lai Western Blot với kháng thể kháng
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
ứng với 6xHis-MPI. Từ đĩ cĩ thể kết luận rằng chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins nuơi cấy tạo giống mầm cĩ khả năng biểu hiện 6xHis- MPI vượt mức khi được cảm ứng bằng IPTG và giống mầm này cĩ thể sử dụng được để phục vụ cho các thí nghiệm lên men nghiên cứu cảm ứng biểu hiện sau này.
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, E. coli BL21(DE3)/pET43Ins; 3, E. coli BL21(DE3)/pET43Ins/IPTG.
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins
Nhằm xác định các điều kiện tối ưu để tổng hợp 6xHis-MPI từ chủng E.
coli BL21(DE3)/pET43Ins, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng
độ IPTG và thời gian cảm ứng lên sự biểu hiện 6xHis-MPI.
6xHis-MPI
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận a. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng tối ưu
Để xác định được điều kiện nhiệt độ cảm ứng tối ưu, chúng tơi tiến hành
khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau từ 25oC đến 37oC. Các bước thực hiện như đã
mơ tả trong phần Phương pháp 2.4.6. Kết quả thu nhận được trình bày trên Hình
3.12.
A B
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng biểu hiện tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Cảm ứng biểu hiện ở 25oC; 4, Cảm ứng ở nhiệt độ 30oC; 5, Cảm ứng ở nhiệt độ 35oC; 6, Cảm ứng ở nhiệt độ 37oC.
Kết quả trên Hình 3.12Acho thấy ở các giếng 3, 4, 5, 6 cĩ xuất hiện vạch
protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa được xác nhận là 6xHis-MPI (bằng phương
pháp lai Western Blot, Hình 3.12B) khi được cảm ứng bằng IPTG, trong khi đĩ ở
giếng 2 (khơng cảm ứng) khơng thấy cĩ xuất hiện vạch protein này. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện bằng phầm mềm Quantity One (Biorad) dựa vào đậm độ của vạch protein trên bản điện di SDS-PAGE cho thấy khi nuơi cấy và
cảm ứng biểu hiện chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ở các nhiệt độ khác nhau
từ 25Ỉ 35oC đều cĩ biểu hiện 6xHis-MPI tốt với mức biến động từ 15,4%-
15,9% tổng protein tế bào, ở nhiệt độ cảm ứng 37oC, mức độ biểu hiện là 14,4%.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Chúng tơi chọn điều kiện cảm ứng 30oC để tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu
về sau.
b. Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng biểu hiện tối ưu
Nồng độ chất cảm ứng IPTG cĩ vai trị quan trọng trong việc quyết định
mức độ biểu hiện protein mục tiêu của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Để
xác định được nồng độ cảm ứng biểu hiện tối ưu, chúng tơi tiến hành khảo sát bằng cách thay đổi nồng độ IPTG bổ sung vào trong giai đoạn cảm ứng. Các
bước tiến hành thí nghiệm như đã được trình bày trong phần Phương pháp 2.4.6,
với nhiệt độ cảm ứng là 30oC.Kết quả thu nhận được trình bày trên Hình 3.13.
A B
Hình 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, IPTG 0,1 mM; 4, IPTG 0,2 mM; 5, IPTG 0,3 mM; 6, IPTG 0,4 mM; 7, IPTG 0,5 mM; 8, IPTG 0,6 mM.
Kết quả điện di SDS-PAGE trên Hình 3.13 A cho thấy, khi nuơi cấy chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ cảm ứng bằng IPTG thì đều cĩ sự xuất hiện vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, được xác định là protein dung hợp
6xHis-MPI (giếng 3Ỉ 8). Trong khi đĩ, ở trường hợp khơng cĩ cảm ứng (giếng
2) thì khơng cĩ sự biểu hiện protein này. Khi tăng nồng độ chất cảm ứng IPTG 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
từ 0,1 mM lên 0,3 mM (từ giếng 3 đến giếng 5) thì mức độ biểu hiện 6xHis-MPI tương ứng cũng tăng từ 6,4% lên 9,1%. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,3 mM đến 0,6 mM thì mức độ biểu hiện vẫn khơng thay đổi, dao động ở mức từ 9,1-11,3% (giếng 6, 7, 8). Điều kiện cảm ứng 0,3 mM được chọn làm cơ sở cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau.
c. Khảo sát thời gian cảm ứng biểu hiện tối ưu
Tiến hành khảo sát thời lượng cảm ứng phù hợp nhất để thu nhận protein mục tiêu với điều kiện thực hiện như đã được mơ tả trong phần Vật liệu – Phương pháp và sử dụng các kết quả thu nhận được của các thí nghiệm nghiên cứu trước.
Hình 3.14. Kết quả khảo sát thời lượng cảm ứng tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, cảm ứng16 giờ; 4, cảm ứng 20 giờ; 5, cảm ứng 24 giờ; 6, cảm ứng 28 giờ.
Kết quả thu được trên Hình 3.14 cho thấy khi chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins được cảm ứng bằng IPTG (giếng 3, 4, 5, 6 Hình 3.14 A)
cĩ xuất hiện các vạch protein được xác nhận là 6xHis-MPI bằng phương pháp lai
Western Blot với kháng thể kháng Histidine, (Hình 3.14 B). Trong khi đĩ trên
giếng 2 (khơng cảm ứng) thì khơng cĩ vạch protein này. Ở thời lượng cảm ứng 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
16 giờ, mức độ biểu hiện 6xHis-MPI đạt 9,3%. Khi tăng thời lượng cảm ứng từ 20 giờ đến 28 giờ (giếng 4, 5, 6) thì mức độ biểu hiện cũng tăng và dao động từ 10,4-11,2%. Chúng tơi chọn thời lượng cảm ứng biểu hiện là 20 giờ làm cơ sở cho các nghiên cứu sau.
Từ các kết quả khảo sát thu được trên đây chúng tơi cĩ thể kết luận rằng
điều kiện cảm ứng tối ưu nhất cho việc tổng hợp 6xHis-MPI của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins là nhiệt độ 30oC, nồng độ IPTG 0,3mM trong thời gian 20
giờ. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhĩm tác giả Lê Văn Phủng và cộng sự khi nghiên cứu biểu hiện proinsulin trên vector pET-28a(+)
biểu hiện trong E. coli BL21(DE3) [7], tuy nhiên nồng độ IPTG cần thiết cho
cảm ứng tối ưu chỉ cần 0,3mM, nhỏ hơn trong báo cáo trên (0,4mM). Chúng tơi sử dụng các điều kiện này để nuơi cấy cảm ứng biểu hiện MPI cho các thí nghiệm về sau.
3.2.3. Xác định điều kiện nuơi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ở qui mơ phịng thí nghiệm pET43Ins ở qui mơ phịng thí nghiệm
a. Thay thế trypton bằng pepton trong mơi trường LB
Nhằm mục tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu rẻ tiền dùng cho lên men qui mơ lớn sau này, chúng tơi chọn pepton thay thế trypton trong mơi trường LB (giá của trypton là 1,955,000 đồng/kg cao gấp khoảng 1,5 so với của pepton, 1,324,000 đồng/kg (HIMEDIA, INDIA) (Việt Á, 2009)). Mơi trường LB với thành phần cĩ pepton được gọi là LBp. Tiến hành khảo sát sự tăng trưởng của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trên mơi trường nuơi cấy LB và LBp được
thực hiện như trong phần Phương pháp 2.4.7. Kết quả sau 6 giờ nuơi cấy (lúc kết
thúc pha tăng trưởng) được ghi nhận trên Hình 3.15 cho thấy khuynh hướng biến
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0 1 2 3 4 5 6
Thời gian nuơi cấy, giờ
OD 600nm 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 pH OD LB OD LBp pH LB pH LBp
pH của mơi trường LBp luơn ở mức thấp hơn khoảng 0,2-0,5 đơn vị pH. Nguyên nhân là do pH của mơi trường LBp nhỏ hơn pH của mơi trường LB, do pH của pepton nhỏ hơn pH của trypton. Tuy nhiên khơng thấy cĩ sự khác biệt động học tăng trưởng của chủng trên hai loại mơi trường này. Như vậy, mặc dù pH của mơi trường LBp nhỏ hơn pH của mơi trường LB nhưng khơng gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chủng. Giá trị pH thấp nhất khi nuơi cấy trên mơi trường LBp là 6,35 ở thời điểm nuơi cấy giờ thứ 2,5. Điều này cho thấy chủng cĩ thể tăng trưởng tốt ở giá trị pH thấp khoảng 6,30. Kết quả phân tích trọng lượng tế bào khơ (DCW) khi kết thúc quá trình lên men ở mơi trường LBp là 4,9 g/L, cao hơn trong trường hợp nuơi cấy trên mơi trường LB, 4,5 g/L.
Hình 3.15. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins và sự biến động pH theo thời gian khi nuơi cấy trên mơi trường LBp và mơi trường LB.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Để đánh giá khả năng biểu hiện của chủng khi nuơi cấy trên mơi trường
LBp so với mơi trường LB, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nuơi cấy chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins trên mơi trường LB và LBp bằng phương pháp nuơi cấy mẻ trên hệ thống lên men mini-jar ở qui mơ 5 L. Các bước thao tác như đã được
mơ tả trong phần Phương pháp 2.4.8. Các điều kiện kiểm sốt lên men theo các
kết quả thu nhận được từ các thí nghiệm trước. Kết quả kiểm tra mức độ biểu hiện theo phương pháp SDS-PAGE và xác nhận sự biểu hiện này bằng phương
pháp Western Blot được trình bày trên Hình 3.16. Kết quả trên Hình 3.16 A cho
thấy ở giếng 3 (LBp), giếng 4 (LB) cĩ xuất hiện vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa được xác nhận là 6xHis-MPI với mức độ biểu hiện tương ứng 18,5% và 17,5%. Ở giếng 1 (chứng âm) khơng thấy sự xuất hiện của vạch protein này. Kết quả biểu hiện này được xác nhận bằng phương pháp Western Blot lai với kháng thể kháng Histidine cho thấy protein biểu hiện trên giếng 3 và giếng 4 chính là 6xHis-MPI (Hình 3.16, B).
Hình 3.16. So sánh mức độ biểu hiện 6xHis-MPI khi nuơi cấy E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins trên mơi trường LBp với mơi trường LB.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Mơi trường LBp; 4, Mơi trường LB.
6xHis-MPI 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Các kết quả thu nhận được trên đây cho phép khẳng định rằng cĩ thể thay thế trypton trong mơi trường LB bằng pepton mà khơng gây bất kỳ ảnh hưởng xấu nào đối với sự tăng trưởng cũng như mức độ biểu hiện protein mục tiêu
6xHis-MPI chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Từ đây, chúng tơi sử dụng
pepton để thay thế cho trypton trong pha chế mơi trường nuơi cấy cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau.
b. Khảo sát điều kiện nuơi cấy mật độ cao
Do protein mục tiêu 6xHis-MPI được tổng hợp trong tế bào chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins dưới dạng khơng tan trong tế bào chất nên để thu nhận được nhiều 6xHis-MPI cần phải lên men và cảm ứng thu nhận lượng lớn sinh
khối E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Để thu nhận lượng sinh khối lớn của tế bào
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ khả năng biểu hiện 6xHis-MPI, chúng tơi
tiến hành thí nghiệm nuơi cấy mẻ-bổ sung mật độ tế bào cao với các mơi trường
khảo sát là H-LBp và aH-LBp được thiết kế trên cơ sở của mơi trường LBp cĩ
thành phần đơn giản, rẻ tiền nhưng vẫn bảo đảm được các yếu tố khống vi lượng cần thiết để vi sinh vật cĩ thể tăng trưởng và biểu hiện tốt (Bảng 2.2). Các bước tiến hành và các điều kiện kiểm sốt nuơi cấy như đã được mơ tả trong
phần Phương pháp 2.4.9 và sử dụng kết quả của các thí nghiệm trước. Kết quả
theo dõi quá trình tăng trưởng của chủng thơng qua giá trị OD600nm được trình
bày trên Hình 3.17. Khi nuơi cấy chủng theo phương thức mẻ-bổ sung mật độ tế
bào cao trên mơi trường H-LBp và aH-LBp, từ 0 - 6 giờ nuơi cấy chủng tăng trưởng giống nhau nhưng sau 6 giờ khả năng tăng trưởng của chủng trên mơi trường H-LBp yếu hơn so với trên mơi trường aH-LBp. Điều này cĩ thể giải thích là mơi trường H-LBp bị thiếu hụt một số khống vi lượng cần thiết cho tăng trưởng khi nuơi cấy mật độ tế bào cao. Khi bổ sung các khống này vào
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 4 8 12 16 20 24 28
Thời gian nuơi cấy
OD 6 0 0nm (*30 ) H-LBp aH-LBp
mơi trường nuơi cấy như trong trường hợp của aH-LBp thì sự tăng trưởng của chủng được duy trì ở mức cao cho đến khi kết thúc quá trình lên men.
Kết quả phân tích DCW khi kết thúc lên men cũng cho thấy ở trường hợp nuơi cấy trên mơi trường aH-LBp là 28,76 g/L, cao hơn so với trên mơi trường H-LBp, 25,48 g/L. Hiệu suất thu nhận sinh khối trên mơi trường aH-LBp cao hơn trên mơi trường H-LBp khoảng 13% do mơi trường aH-LBp cĩ chứa nhiều thành phần khống, phù hợp cho việc tổng hợp sinh khối cao. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của Shin et al (1997) [59] khi nuơi cấy E. coli mật độ tế bào cao phải bổ sung các khống vi lượng vào trong thành phần mơi trường, tuy nhiên hiệu suất thu nhận sinh khối thì thấp hơn. Nguyên nhân cĩ thể là do sự khác biệt về thành phần mơi trường và một số điều kiện lên men. Mơi
Hình 3.17. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins khi nuơi cấy mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao trên hai mơi trường H-LBp và aH-LBp.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
trường nuơi cấy sử dụng trong nghiên cứu là aH-LBp cĩ thành phần khác với mơi trường trong báo cáo của Shin (sử dụng glucose nồng độ làm cơ chất và bổ sung dung dịch ion kim loại hỗn hợp (trace elements solution)).
Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp 6xHis-MPI khi nuơi cấy mẻ-bổ sung mật độ tế bào cao trong cả hai trường hợp mơi trường H-LBp và aH-LBp được trình bày trên Hình 3.18.
Hình 3.18. So sánh mức độ biểu hiện 6xHis-MPI khi nuơi cấy E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao trên mơi trường H-LBp với mơi trường aH-LBp.
A, SDS-PAGE ; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Mơi trường H-LBp; 4, Mơi trường aH-LBp.
Ở giếng 3 và 4 (Hình 3.18 A) cĩ xuất hiện các vạch protein cĩ kích thước
khoảng 9 kDa, với mức độ biểu hiện như nhau, tương ứng là 17,2% và 17,4%, được xác định là 6xHis-MPI. Ở giếng 2 (chứng âm) khơng thấy sự xuất hiện của vạch protein này. Kết quả biểu hiện này được xác nhận bằng phương pháp