sản xuất protein tái tổ hợp
Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng lên sự tổng hợp protein đặc trưng từ tế bào E.
coli tái tổ hợp: sự tương tác giữa vector và tế bào chủ, tính ổn định của plasmid,
hiệu quả cảm ứng của hệ thống promotor, tính ổn định của protein, nồng độ sinh khối… [59]. Mục tiêu quan trọng của quá trình lên men là tăng cường tối đa hiệu suất tạo sản phẩm theo thể tích lên men, tức là trong thời gian ngắn nhất, lượng sản phẩm thu được trong một đơn vị thể tích là cao nhất. Do vậy, nuơi cấy tế bào
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
mật độ cao là phương án rất quan trọng để hướng đến mục tiêu trên. Nĩi chung, trong sản xuất protein tái tổ hợp bởi E. coli thì khi mật độ tế bào càng cao, lượng
protein được sản xuất càng lớn. Việc nuơi cấy E. coli đạt mật độ cao đã được
nghiên cứu nhiều từ những năm 1970, chủ yếu tập trung vào việc cải tiến các kỹ thuật, phương pháp nuơi cấy, tối ưu hĩa thành phần mơi trường. Hiện nay, người
ta đã thành cơng trong việc nuơi cấy E. coli mật độ cao cĩ thể đạt đến 190 g sinh
khối khơ/ L mơi trường [58]. Do hầu hết các protein mục tiêu là sản phẩm nội
bào được tích lũy bên trong tế bào E. coli tái tổ hợp nên lượng sản phẩm thu
được tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào và hiệu suất sản xuất đặc trưng của chủng.
Kỹ thuật nuơi cấy E. coli tái tổ hợp mật độ cao đã được phát triển nhằm mục
đích cải thiện sản lượng và cĩ nhiều ưu điểm như làm giảm thể tích dịch nuơi cấy, tăng hiệu quả cho các qui trình thu hồi, giảm chi phí đầu tư, chi phí [75].
- Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy
Thành phần mơi trường phải được thiết lập và theo dõi kỹ lưỡng vì chúng cĩ vai trị quan trọng trong quá trình biến dưỡng để tạo sinh khối tế bào và sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Để nuơi cấy tế bào đạt mật độ cao, cần phải thiết kế một mơi trường cĩ sự cân đối về các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho tế bào tăng trưởng và tránh được các tác nhân gây ức chế tế bào [75]. Một trong những
cách để đạt được tế bào E. coli mật độ cao là tối ưu hĩa mơi trường tăng trưởng
dùng để nuơi cấy trong giai đoạn đầu. Cần lưu ý rằng một số thành phần dinh dưỡng như nguồn carbon, nguồn nitrogen cĩ thể ức chế tăng trưởng khi ở nồng
độ cao (Bảng 1.2) [58]. Ngồi ra, do một số thành phần trong mơi trường tổng
hợp như pepton, cao nấm men cĩ thể thay đổi giữa các mẻ xuất xưởng do vậy cĩ thể gây nên sự biến động giữa các mẻ nuơi cấy.
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Bảng 1.2. Nồng độ gây ức chế của một số thành phần trong mơi trường nuơi cấy
Thành phần Hàm lượng gây ức chế tăng trưởng
Glucose > 50 g/L NH3 > 3 g/L Fe > 1,15 g/L Mg > 8,7 g/L P > 10 g/L Zn > 0,038 g/L
Trong nuơi cấy mẻ-bổ sung E. coli, phương án bổ sung dinh dưỡng sẽ
quyết định sự thành cơng của quá trình nuơi cấy tế bào đạt mật độ cao. Nuơi cấy mẻ-bổ sung thường được thực hiện trong điều kiện cĩ sự giới hạn về dinh dưỡng nhưng mơi trường được bổ sung trong quá trình nuơi cấy bằng các phương án khác nhau như bổ sung với tốc độ ổn định, tăng theo bậc hoặc tăng liên tục theo hàm số mũ (Hình 1.15). Thời gian Nồng độ tế bào Tốc độ bổ sung dinh dưỡng (a) Thời gian Nồng độ tế bào Tốc độ bổ sung dinh dưỡng (b) Thời gian Nồng độ tế bào Tốc độ bổ sung dinh dưỡng (c)
Hình 1.15. Động học tăng trưởng tế bào trong nuơi cấy mẻ- bổ sung với tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau.
(a) Tốc độ cố định; (b) Tốc độ tăng dần từng bước; (c) Tốc độ tăng theo hàm mũ.
Khi được bổ sung với tốc độ khơng đổi thì lượng dinh dưỡng cấp vào ổn định, tuy nhiên nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật tăng lên, gây nên sự thiếu hụt cơ chất làm cho tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng liên tục bị suy giảm. Trường hợp bổ sung theo tốc độ tăng dần từng bước, nồng độ chất dinh dưỡng được bổ sung tăng khi nồng độ tế bào tăng cao, do vậy sự suy giảm tốc độ tăng
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
trưởng tế bào được bù đắp liên tục. Với kiểu bổ sung liên tục tăng dần, chất dinh dưỡng được nạp vào theo nhu cầu của tế bào để duy trì sự ổn định tốc độ tăng trưởng. Tốc độ bổ sung dinh dưỡng cĩ thể được kiểm sốt tự động dựa vào hàm lượng của cơ chất giới hạn trong mơi trường nuơi cấy [75]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ảnh hưởng của chế độ bổ sung dinh dưỡng sau cảm ứng
Sau khi cảm ứng, sự tăng trưởng và hoạt tính biến dưỡng của tế bào chủ bị ảnh hưởng do sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp. Phương pháp bổ sung dinh dưỡng trong pha sau cảm ứng rất quan trọng trong việc tăng cường hiệu quả sản xuất protein tái tổ hợp. Do sinh lý của tế bào chủ thay đổi khi được cảm ứng tổng hợp protein ngoại lai nên cần phải điều chỉnh chiến lược bổ sung dinh dưỡng. Các nghiên cứu đã cơng bố cho thấy rằng tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng trong pha sau cảm ứng khơng phụ thuộc vào tốc độ bổ sung dinh dưỡng. Tuy nhiên, sự sinh tổng hợp protein mục tiêu bị ảnh hưởng đáng kể theo phương thức bổ sung dinh dưỡng. Khi thay đổi tốc độ bổ sung dinh dưỡng liên tục tăng theo thời gian với một tỷ lệ thích hợp cĩ thể làm tăng hiệu quả biểu hiện protein mục tiêu cao hơn nhiều so với các chế độ bổ sung dinh dưỡng khác.
- Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
Thời điểm cảm ứng cĩ ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng lên sản lượng protein tái tổ hợp của cả quá trình. Kết quả nghiên cứu sự biểu hiện của protein leptin bằng phương pháp lên men mẻ- bổ sung khi dùng IPTG cảm ứng ở những thời điểm cĩ mật độ tế bào khác nhau cho thấy năng suất tạo leptin đặc trưng cao nhất khi được cảm ứng ở mật độ tế bào thấp. Tuy nhiên, sản lượng của tồn quá trình (theo thể tích) là cao nhất khi tế bào được cảm ứng ở mật độ trung bình
(OD600 = 90). Khi cảm ứng biểu hiện ở mật độ tế bào cao (OD600 = 140) tốc độ
Luận án Tiến sĩ Tổng quan - Ảnh hưởng của các yếu tố hĩa lý (pH, nhiệt độ, hàm lượng ơxi hồ
tan) lên quá trình lên men mẻ-bổ sung
Bên cạnh các yếu tố liên quan đến hệ thống thiết bị dùng trong qui trình lên men, cần phải theo dõi và kiểm sốt các thơng số hĩa lý quan trọng như hàm lượng ơxi hịa tan trong dịch lên men, độ pH, nhiệt độ nuơi cấy và cả độ khuấy trộn trong mơi trường nuơi cấy. Khi cĩ bất kỳ sự thay đổi nào của các thơng số này cũng đều gây nên những ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tế bào và tính ổn định của sản phẩm protein mục tiêu.
Trong nuơi cấy tế bào mật độ cao sản xuất protein tái tổ hợp, nồng độ ơxi hịa tan (DOC) trong mơi trường nuơi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất. DOC cĩ thể được kiểm sốt bằng cách thay đổi tốc độ khuấy trộn, tăng cường tốc độ sục khí, hay bổ sung ơxi tinh khiết [12].
Do lượng ơxi hịa tan trong mơi trường lỏng cĩ giới hạn (tối đa 8,4 ppm ở
25oC) nên ơxi cần được cung cấp liên tục trong quá trình nuơi cấy thơng qua hệ
thống sục khí. Tuy nhiên, việc sục khí vào mơi trường nuơi cấy thường tạo ra bọt khí và nếu kích thước bọt khí càng lớn thì tốc độ hịa tan của ơxi vào nước giảm, tăng trưởng của chủng khĩ đạt cực đại. Cần chọn tốc độ khuấy trộn phù hợp để làm tan các bọt khí, tăng cường độ hồ tan của ơxi.
Hầu hết vi sinh vật tăng trưởng tối ưu ở pH từ 5,5-8,5. Trong quá trình tăng trưởng, các chất trao đổi trung gian được tiết ra mơi trường làm cho pH của mơi trường thay đổi. Do vậy pH mơi trường nuơi cấy cần phải được theo dõi và hiệu chỉnh bằng acid hoặc bằng base để bảo đảm pH được ổn định trong quá trình nuơi cấy.
Nhiệt độ là một trong những thơng số thiết yếu quyết định sự thành cơng của quá trình lên men. Ở nhiệt độ thấp, vi sinh vật tăng trưởng chậm, ngược lại nếu nhiệt độ cao (nhưng khơng vượt quá nhiệt độ gây chết tế bào) cĩ thể gây
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
nên hiện tượng biểu hiện sớm protein mục tiêu ở các hệ thống kiểm sốt biểu hiện cảm ứng nhiệt, làm giảm hiệu quả biểu hiện các protein tái tổ hợp [28].
- Ảnh hưởng của acid hữu cơ trong lên men mẻ- bổ sung E. coli
Một trong những vấn đề quan trọng khi nuơi cấy E. coli mật độ cao là
phải kiểm sốt tốc độ tăng trưởng vì nĩ cĩ ảnh hưởng rất lớn đối với sự hình
thành các sản phẩm phụ và các chất gây ức chế cho tế bào. Khi nuơi cấy E. coli,
acetate được tổng hợp rất nhiều khi tốc độ tăng trưởng đặc trưng (μ) đạt trên
0,35 giờ-1 đối với mơi trường xác định và khi đạt trên 0,2 giờ-1 đối với mơi trường
tổng hợp [38], [44]. Mơi trường sử dụng để nuơi cấy E. coli mật độ cao sản xuất
các sản phẩm tái tổ hợp thường cĩ chứa glucose. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của
E. coli trong mơi trường cĩ chứa glucose trong điều kiện hiếu khí cĩ thể tạo ra các sản phẩm phụ cĩ tính acid đặc biệt là acetic acid. Acetic acid là một thành phần gây ức chế tăng trưởng của E. coli được sinh ra bởi chính E. coli trong điều kiện thiếu ơxi, cũng như trong điều kiện thừa glucose. Trong phương pháp lên men mẻ-bổ sung, nếu glucose được nạp vào mơi trường nuơi cấy với tốc độ cao để đạt được tốc độ tăng trưởng đặc trưng cực đại thì rất dễ tạo điều kiện cho việc hình thành acetic acid trong mơi trường nuơi cấy, làm giảm khả năng sản xuất protein tái tổ hợp [27],[28]. Để khắc phục tình trạng này, cĩ thể sử dụng glycerol
thay cho glucose, hạ nhiệt độ nuơi cấy hoặc dùng các chủng E. coli đã biến đổi
di truyền cĩ khả năng chuyển acetate thành những chất kém độc tính hơn đối với chủng nuơi cấy [28].