Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng Lactobacillus : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRỊNH TẤT CƢỜNG Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Tất Cường người thầy hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giảng dạy khoa Sinh học làm sở cho thực tốt luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán bộ, anh, chị bạn Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014 Học viên Lý Thị Kim Tuyến i MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA) 1.2 Cấu trúc hình dạng GABA 1.3 Quá trình tổng hợp chức GABA não 1.4 Enzym tổng hợp GABA 1.5 Thụ thể GABA 1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật 1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA 1.8 Thực phẩm chức GABA 10 1.8.1 Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức chứa GABA 10 1.8.2 Nghiên cứu GABA Việt Nam 10 1.9 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể 11 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .14 2.1 NGUYÊN LIỆU .14 2.1.1 Vi sinh vật 14 2.1.2 Các mẫu cám gạo .14 2.1.3 Các dòng tế bào 14 2.1.4 Máy móc dụng cụ 14 2.1.5 Các hóa chất, nguyên liệu khác 14 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo 15 2.2.1.1 Nuôi cấy bảo quản chủng KC1 .15 2.2.1.2 Kiểm tra khả sinh GABA chủng KC1 16 2.2.1.3 Đánh giá chất lƣợng cám gạo .16 2.2.1.4 Xác định hoạt tính glutamate decacboxylase cám gạo .19 2.2.1.5 Xác định glutamic axit phƣơng pháp sắc ký mỏng (TLC) 19 ii 2.2.1.6 Định lƣợng glutamic acid phƣơng pháp so màu 19 2.2.1.7 Chiết xuất glutamic acid cám gạo phƣơng pháp nƣớc sôi 20 2.2.1.8 Xác định GABA phƣơng pháp sắc ký mỏng (TLC) [41] 20 2.2.1.9 Định lƣợng GABA phƣơng pháp so màu [57] 21 2.2.1.10 Xác định nguồn vô hữu thích hợp lên men 22 2.2.1.11 Tìm điều kiện lên men thích hợp mơi trƣờng dịch cám gạo 23 2.2.2 Tinh chế GABA [31] 24 2.2.2.1 Khử màu 24 2.2.2.2 Khử muối 24 2.2.2.3 Chạy sắc ký trao đổi ion 24 2.2.2.4 Kết tinh GABA 25 2.2.3 Đánh giá hoạt tính GABA 25 2.2.3.1 Nuôi tế bào WSS-1 tế bào PC12 25 2.2.3.2 Đánh giá khả sống chết tế bào .26 2.2.3.3 Xác định GABA phƣơng pháp HPLC [42] 26 2.2.3.4 Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào thay đổi màu iot [49] .26 2.2.3.5 Định lƣợng GABA dựa vào thay đổi màu iot 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo .29 3.1.1 Khả sinh GABA chủng KC1 .29 3.1.2 Các tiêu chất lƣợng an toàn thực phẩm cám gạo 29 3.1.3 Đánh giá hoạt động GAD cám gạo 30 3.1.4 Xác định thành phần lựa chọn nguyên liệu cám gạo 31 3.1.4.1 Xác định định tính glutamic acid hai mẫu cám gạo 31 3.1.4.2 Định lƣợng glutamic acid hai mẫu cám gạo .32 3.1.5 Lƣợng glutamic acid thu đƣợc phƣơng pháp nƣớc sôi 34 3.1.6 Đƣờng chuẩn GABA xác định hàm lƣợng GABA phƣơng pháp so màu 35 iii 3.1.7 Nguồn vô hữu thích hợp lên men 36 3.1.8 Các điều kiện lên men thích hợp môi trƣờng dịch cám gạo .40 3.1.8.1 pH thích hợp cho lên men 40 3.1.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho lên men 41 3.1.8.3 Thời gian thích hợp cho lên men 42 3.1.8.4 Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men 43 3.1.9 Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo 45 3.2 Đánh giá hoạt tính GABA phƣơng pháp sắc ký mỏng 46 3.3 Đánh giá hoạt tính GABA .47 3.3.1 Đánh giá khả sống chết tế bào PC12 47 3.3.2 Xác định GABA HPLC .48 3.3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thơng qua thụ thể 52 3.3.3.1 Nuôi cấy tế bào WSS-1 .52 3.3.3.2 Đánh giá hoạt tính GABA thơng qua bắt màu Iot dòng tế bào WSS-1 53 3.3.3.3 Định lƣợng GABA dựa vào thay đổi màu iot 54 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GABA Axit gamma-amino butylric GABA-T GABA transaminase GAD L-glutamate decarboxylase HTS Phƣơng pháp sàng lọc High throughput screening KC1 Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT ml milliliter mM millimolar MRS De Man, Rogosa, Sharpe MSG Monosodium glutamate OD Mật độ quang học PLP Pyridoxalphosphate TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLC Thin layer chromatography TPCN Thực phẩm chức v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cấu trúc GABA .4 Hình Con đƣờng tổng hợp phân hủy GABA .5 Hình 3: Mơ hình cấu trúc thụ thể GABAA Hình 4: Mơ hình cấu trúc thụ thể GABAB Hình 5: Hoạt động thụ thể trƣớc sau gắn kết với GABA Hình 6: Kết chạy sắc ký TCL dịch lên men mơi trƣờng MRS 29 Hình 7: Hoạt tính GAD cám gạo đƣợc xác định thơng qua MSG 31 Hình 8: Kết xác định glutamic acid cám gạo TLC 32 Hình 9: Đƣờng chuẩn glutamic acid .33 Hình 10: Hiệu nhiệt độ thời gian trình thủy phân glutamic acid từ cám gạo 35 Hình 11: Đƣờng chuẩn GABA 36 Hình 12: Hiệu NaCl trình phát triển tế bào sản xuất GABA 37 Hình 13: Ảnh hƣởng pH tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 41 Hình 14: Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 42 Hình 15: Ảnh hƣởng thời gian tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 43 Hình 16: Ảnh hƣởng ơxy tới q trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 44 Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo .45 Hình 18: Sản phẩm GABA sau đơng khơ (A), sau tinh chế (B) .46 Hình 19: Kiểm tra GABA TLC 46 vi Hình 20: Khả bảo vệ tế bào PC12 dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT 48 Hình 21: Sắc ký đồ GABA chuẩn 49 Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC .49 Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men .50 Hình 24: Chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột .51 Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh mẫu 52 Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi sau 24 ni cấy tế bào WSS-1 (A), sau 48 (B) 53 Hình 27: Kết thay đổi OD Iot dựa vào thay đổi nồng độ GABA lên men 54 Hình 28: Đƣờng chuẩn nồng độ GABA mật độ quang bƣớc sóng 405nm 55 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS .15 Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng hai mẫu cám gạo 30 Bảng 4: Giá trị glutamic acid mẫu cám gạo 33 Bảng 5: Lƣợng GABA mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon 38 Bảng 6: Lƣợng GABA mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ .39 Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hƣởng tới hiệu suất tạo GABA hai loại môi trƣờng 40 Bảng 8: Hàm lƣợng GABA dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo .55 viii 500 mAU 358nm,4nm (1.00) 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Hình 21: Sắc ký đồ GABA chuẩn Tiến hành chạy sắc ký GABA chuẩn nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50 µl chúng tơi xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn GABA hình 22, đƣờng chuẩn sở xác định đƣợc nồng độ GABA mẫu dịch nghiên cứu Conc.(x10) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC Tiếp tục chạy sắc ký dịch lên men thô nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tơi thu đƣợc sắc ký đồ có nhiều pic khác (hình 23) Tuy nhiên, sắc ký đồ cho pick giống với pick GABA chuẩn sau 19 phút thơi cột Điều cho phép chúng tơi khẳng định lần dịch lên men sinh GABA 49 mAU 150 358nm,4nm (1.00) 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men Sau chạy sắc ký mẫu dịch lên men thô, tiến hành chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột để kiểm tra độ tinh GABA mẫu dịch lên men, kết hình 24C cịn pick xuất phút 19, pick GABA mẫu lên men 50 mAU 358nm,4nm (1.00) 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 A mAU 358nm,4nm (1.00) 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 B 500 mAU 358nm,4nm (1.00) 400 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 C Hình 24: Chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột Để kiểm tra độ tinh mẫu dịch lên men chạy sắc ký mẫu lên men sau tinh với nồng độ 20 µl đƣa vào đƣờng chuẩn GABA, kết hình 25 cho thấy GABA mẫu dịch lên men sau tinh đạt độ tinh cao 96,7% 51 Level Conc 10 20 30 40 50 Mean Area 2516827 6154657 9151430 12149212 16341778 S % RSD Area 2516827 6242833 9151430 12149212 16341778 124699.2 2.026095 Area 6066482 0 Conc.(x10) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh mẫu  Kết mẫu tinh đạt độ tinh cao 96,7 % 3.3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể 3.3.3.1 Nuôi cấy tế bào WSS-1 Việc nuôi tế bào WSS-1 phát triển vấn đề định đến trình thử hoạt tính GABA Chính vậy, tế bào đƣợc tiến hành nuôi cấy điều kiện vô trùng nghiêm ngặt theo phần phƣơng pháp Sau tế bào đƣợc nuôi tủ nuôi cấy tế bào với tỉ lệ CO2 5%, nhiệt độ 37°C đƣợc quan sát kính hiển vi Kết hình 26A cho thấy tế bào dính kết tăng sinh nhiều sau 24 Tỉ lệ tế bào tiếp tục tăng sinh lên sau 48 (hình 26B) 52 A B Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi sau 24 ni cấy (A), sau 48 nuôi cấy (B) 3.3.3.2 Đánh giá hoạt tính GABA thơng qua bắt màu Iot dịng tế bào WSS-1 Việc đánh giá hoạt tính GABA sau sản xuất định chất lƣợng tồn cơng nghệ sản xuất lên men từ dịch cám gạo sản phẩm tạo khơng có hoạt tính sản phẩm khơng có ý nghĩa dƣợc tính khơng có tác động đến điều trị bệnh Chính vậy, việc đánh giá hoạt tính dựa vào tác động thụ thể GABA dịng tế bào WSS-1 có ý nghĩa vơ quan trọng Chúng tơi áp dụng dịng tế bào việc xác định hoạt tính sinh học dịch GABA sau lên men Tế bào đƣợc phân chia vào giếng đĩa 96 giếng thao tác theo phần phƣơng pháp Tế bào giếng đĩa 96 đƣợc đem đo khả hấp thụ quang học bƣớc sóng 405 nm Kết đọc đƣợc ghi lại sử dụng phần Xcell cho kết hình 27 Từ kết cho thấy, tế bào không đƣợc xử lý GABA khả hấp thụ Iot gần nhƣ Tuy nhiên, tế bào đƣợc xử lý GABA chuẩn nồng độ GABA lên men dạng thơ khả thay đổi màu Iot rõ ràng 53 Hình 27: Kết thay đổi OD Iot dựa vào thay đổi nồng độ GABA lên men 3.3.3.3 Định lƣợng GABA dựa vào thay đổi màu iot Phƣơng pháp định lƣợng GABA so màu thơng thƣờng cho kết xác đƣợc áp dụng từ nhiều năm Tuy nhiên, việc định lƣợng khơng tác động lên đích thực hoạt động tế bào Chính vậy, thực phƣơng pháp định lƣợng GABA dịch lên men phƣơng pháp so màu với Iôt để từ mật độ quang thu đƣợc suy nồng độ GABA đánh giá ln đƣợc hoạt tính Điều có vai trị quan trọng q trình phát triển thực phẩm chức để xác định sản phẩm có tác động thực lên đích tế bào hay khơng Để đánh giá đƣợc xác hàm lƣợng GABA đƣợc tạo thành dịch lên men cần phải xây dựng đƣờng chuẩn GABA Dựa vào đƣờng chuẩn đo đƣợc hàm lƣợng GABA dịch lên men cách suy từ mật độ quang thu đƣợc  Xây dựng đường chuẩn Một dải nồng độ GABA đƣợc pha nhƣ phần phƣơng pháp Sau đó, nồng độ đƣợc đƣa vào đĩa có chứa tế bào WSS-1 Sau đó, tế bào đƣợc đem đánh giá khả hấp thụ màu bƣớc sóng 405 máy ELISA 6860 Kết 54 cho đƣờng chuẩn GABA (hình 28) Dựa vào đƣờng chuẩn này, suy đƣợc nồng độ GABA mẫu cần đo OD405 y = 0.0003x + 0.9097 R² = 0.9824 1.1 1.05 0.95 0.9 100 200 300 400 500 600 Nồng độ GABA (mM) Hình 28: Đƣờng chuẩn nồng độ GABA mật độ quang bƣớc sóng 405 nm  Xác định hàm lượng GABA dịch lên men Để đánh giá đƣợc độ xác phƣơng pháp định lƣợng thông qua thụ thể GABA phƣơng pháp so màu Chúng lấy mẫu lên men đo hai phƣơng pháp Kết đƣợc bảng Từ kết cho thấy hàm lƣợng GABA đo hai phƣơng pháp khơng có khác Nhƣ vậy, phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng GABA thơng qua thụ thể đƣợc áp dụng phƣơng pháp so với phƣơng pháp so màu cho kết giống ngồi phƣơng pháp có khả đánh giá đƣợc hoạt tính GABA trực tiếp tế bào Bảng 9: Hàm lƣợng GABA dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo Phƣơng pháp đánh giá GABA (mM) so màu thông thƣờng 672 so màu iot 670 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài hoàn thành với kết nhƣ sau: Quy trình lên men từ chủng Lactobacillus plantarum KLEPT môi trƣờng dịch cám gạo đạt hiệu bổ sung thêm 1% NaCl, 1% glucose, 1% cao nấm men, 12% mỳ cho 10 lít dịch lên men Xác định đƣợc thơng số dùng lên men GABA thích hợp pH 6,5; nhiệt độ 340C; thời gian 96 h; tỉ lệ oxi 40% Đánh giá hoạt tính GABA trực tiếp tế bào theo phƣơng pháp so màu Iot cho kết tƣơng đƣơng với phƣơng pháp so màu thơng thƣờng Kiến nghị Tiếp tục hồn thiện phƣơng pháp tinh chế GABA công nghệ kết tinh Bƣớc đầu đánh giá hiệu GABA động vật ngƣời Triển khai lên men dạng quy mô công nghiệp 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt: Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kĩ thuật Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sƣ phạm Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng (2002), Receptor màng tế bào tác dụng thuốc, NXB Y học, Hà Nội Tiếng anh: Abe Y., Umemura S., Sugimoto K.I., Hirawa N., Kato Y., Yokoyama N Yokoyama T., Junichi I., Masao I (1995), “Effect of green tea rich in γ aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American Journal of Hypertens 8(1), 74-79 Ali F.W.O., Abdulamir A.S., Mohammed A.S., Bakar F.A., Manap Y.A., Zulkifli A.H., Saari N (2009), “Novel, Practical and Cheap Source for Isolating Beneficial gamma-Aminobutyric Acid-Producing Leuconostoc NC5 Bacteria”, Research Journal of Medical Science,3(4) 146-153 Bautista G.M., Lugay J.C., Cruz L.J., Juliano B.O (1964), “Glutamic acid decarboxylase activity as a viability index of artificial dried and stored rice”, Cereal Chem, 41 188-191 Cagno R D., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D (2009), “Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, 86 731-741 Connor M.A., Saunders R.M., Kohler G.O (1977), “Preparation and properties of protein concentrates obtained by wet alkali processing of rice bran”, Rice Byproducts Utilization International Conference, IACFT, Spain 57 10 Cross M L (2004), “Immune-signaling by orally-delivered probiotic bacteria: Effects on common mucosal immunoresponses and protection at distal mucosal sites”, J Immunopathol Pharmacol, 17 127-134 11 Chin H.S., Breidt F., Fleming H.P., Shin W.C., Yoon S.S (2006), “Identification of predominant bacterial isolates from the fermenting kimchi using ITS-PCR and partial 16S rDNA sequence analyses”, J Microbiol Biotechnol,16 68-76 12 Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C (2007), “Production of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells”, J Microbiol Biotechnol, 17 104-109 13 Choi S I., Lee J W., Park S M., Lee M Y., Ji G E., Park M S., Heo T R (2006), “Improvement of γ-aminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis”, J Microbiol Biotechnol, 16 562-568 14 Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., De Angelis M., Giuliani G., Meloni M., De Servi B., Gobbetti M (2009), "Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications", Appl Microbiol Biotechnol, 86 41731 15 Foester C.W., Foester H F (1973), “Glutamic acid decarboxylase in spores of Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination”, J Bacteriol, 114 1090-1098 16 Hayakawa K., Masayuki K., Yamori Y (2005), “Role of the renal nerves in γaminobutyric acid-induced anti-hypertensive effect in spontaneously hypertensive rats”, European Journal of Pharmacology, 524 120-125 17 Inglese J (2007), “High-throughput screening assays for the identification of chemical probes”, Nature chemical biology, 466-479 18 Jannoey P., Niamsup H., Lumyong S., Tajima S., Nomura M., Chairote G (2010), “γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulations in Rice During Germination”, Chiang Mai J, 37(1) 124-133 58 19 Jeun J.H., Kim H.D., Lee H.S., Ryu B.H (2004), “Isolation and identification of Lactobacillus sp produced γ-aminobutyric acid (GABA) from traditional salt fermented anchovy”, Kor J Food Nutr, 72-79 20 Jin Z., Mendu S.K., Birnir B (2011), GABA is an effective immunomodulatory molecule, Amino Acids, 45 87-94 21 Kang M.S., Cho S.C., Kook M.C., Pyun Y.R., Choi C.I (2006), “Novel strains of Lactobacillus spp and method for preparing γ-aminobutyric acid using the same”, Korea Patent 10-0549094 22 Kayahara H., Sugiura T (2001), “Research on physiological function of GABA in recent years-improvement function of brain function and anti-hypertension”, Japanese Journal of Food development, 36(6) 4-6 23 Kim S.H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J (2007), “Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2”, Biotechnol Bioprocess Eng, 12 707-712 24 Kinefuchi M., Sekiya M., Yamazaki A., Yamamoto K (1999), “Accumulation of GABA in brown rice by high pressure treatment”, Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 46 323-328 25 Komatsuzake N., Kawamoto S., Momose H., Kimura T (2005), "Production of γ aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods", Food Microbiol, 22 497-504 26 Komatsuzake N., Shima J., Kawamoto S., Momose H., Kimura T (2005), “Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods”, Food Microbial, 22 497-504 27 Kono I., Himeno K (2000), “Changes in γ-aminobutyric acid content during beni-koji making”, Biosci Biotechnol Biochem, 64 617-619 28 Kook M.C (2010), “Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16”, J Microbiol Biotechnol, 20(4) 763-766 59 29 Lee H.Y., Park J.H., Seok S.H., Choi S.A., Baek M.W., Kim D.J., Lee Y., Park J.H (2004), “ Dietary intake of various lactic acid bacteria suppresses type helper T cell production in antigen-primed mice splenocyte”, J Microbiol Biotechnol, 14 167-170 30 Leroy F., De Vuyst L (2004), “Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry”, Trends Food Sci Technol, 15 67-78 31 Li H., Qiu T., Chen Y (2011), “Separation of gamma-aminobutyric acid from fermented broth”, J Ind Microbiol Biotechnol, 38 1955-1959 32 H.X., Gao D.D., Cao Y.S., Xu H.Y (2008), “A high γ-aminobutyric acidproducing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai”, Ann Microbiol, 58 649-653 33 Manyam B.V., Katz L., Hare T.A., Kaniefski K., Tremblay R.D (1981), “Isoniazid-induced elevation of cerebrospinal fluid (CSF) GABA levels and effects on chorea in Huntington’s disease”, Ann Neurol, 10 35-37 34 Nomura M., Fujita Y., Kobayashi M., Kimoto H., Suzuki I., Aso H (1999), "Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene", Microbiology,145 1375-1380 35 Nomura M., Kimoto H., Someya Y., Furukawa S., Suzuki I (1998), “Production of gamma-aminobutyric acid by cheese starters during cheese ripening”, J Dairy Sci, 81 1486-1491 36 Ohtsubo S., Asano S., Sato K., Matsumoto I (2000), “Enzymatic Production of v-Aminobutyric Acid Using Rice (Oryza sativa) Germ”, Food Sci Technol Res, 29 208-211 37 Park K.B., Oh S.H (2007), “ Production of yogurt with enhanced levels of gamma-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract”, Bioresource Technolology, 98(8) 1675-1679 38 Park O (2007), "Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3", Elsevier, 312-329 60 39 Parkash J., Kaur G (2007), “ Potential of PSA-NCAM in neuron-glial plasticity in the adult hypothalamus: Role of noradrenergic and GABAergic neurotransmitters”, Brain Research Bulletin, 74 317-328 40 Peter T Bosma., Martin A Collins., John D.D Bishop., I.G.P Guy Drouin., Kevin Docherty., Vance L Trudeau (1999), "Multiplicity of Glutamic Acid Decarboxylases (GAD) in Vertebrates: Molecular Phylogeny and Evidence for a New GAD Paralog", Soc Mol Biol Evol 397-404 41 Qui T., Li H., Cao Y (2010), “Pre-staining thin layer chromatography method for amino acid detection”, Afr J Biotechnol, 8679-8681 42 Ratanaburee A., Kantachote D., Charernjiratraku., Penjamras P., Chaiyasut C (2011), “ Enhancement of γ-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DW12”, Electronic Journal of Biotechnology,14 0717-3458 43 Roberts K.A., Wright J.W., Harding J.W (1993), “GABA and bicucullineinduced blood pressure changes in spontaneously hypertensive rats”, J Cardiovasc Pharmacol, 21 156-162 44 Sereewatthanawut I., Prapintip S., Watchiraruji., Goto M., Sasaki M., Shotipruk A (2006), “Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis”, Bioresource Technology, 99 555-561 45 Siragusa S., De Angelis M., Di Cagno R., Rizzello C.G., Coda R., Gobbetti M (2007), “Synthesis of gamma-Aminobutyric Acid by Lactic Acid Bacteria Isolated from a Variety of Italian Cheeses”, Applied and Environmental Microbiology, 73 7283-7290 46 Stanton H.C (1963), “Mode of action of gamma amino butyric acid on the cardiovascular system”, Arch Int Pharmacodyn, 143, tr 195-204 47 Sun T.S., Zhao S.P., Wang H.K., Cai C.K., Chen Y.F., Zhang H.P (2009), “ACE-inhibitory activity and gamma-aminobutyric acid content of fermented skim milk by Lactobacillus helveticus isolated from Xinjiang koumiss in China”, Eur Food Res Technol, 228 607-612 61 48 Sun Z., Chen X., Wang J., Zhao W., Shao Y., Guo Z., Zhang X., Zhou Z., Sun T., Wang L., Meng H., Zhang H., Chen W (2011), "Complete Genome Sequence of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Strain ND02", J Bacteriol, 193(13) 3426-3427 49 Tang W, Wildey M.J (2004), “Development of a colorimetric method for functional chloride channel assay”, J Biomolecular Screening, 607-613 50 Tsai J.S., Lin Y.S., Pan B.S., Chen T.J (2006), “ Antihypertensive peptides and gamma-aminobutyric acid from prozyme facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk”, Process Biochem, 41 1282-1288 51 Ueda Y., Doi T., Nagatomo K., Tokumaru J., Takaki M., Willmore L.J (2007), “Effect of levetiracetam on molecular regulation of hippocampal glutamate and GABA transporters in rats with chronic seizures in-duced by amygdalar FeCl3 injection”, Brain Research, 1151 55-61 52 Waagepetersen S (2004), Gamma-aminobutyric acid (GABA), sciencedirect 53 Wang M., Hettiarchchy N.S., Qi M., Burks W., Siebenmorgen T (1999), “Preparation and functional properties of rice bran protein isolate”, J Agric Food Chem, 47 411-416 54 Wong C.G., Bottiglieri T., Snead O.C (2003), “GABA, γ-hydroxybutyric acid and neurological disease”, Ann Neurol, 54 S3-S12 55 Yamakoshi J., Fukuda S., Satoh T., Tsuji R., Salto M., Obata A., Matsuyama A., Kikuchi M., Kawasaki T (2007), “Antihypertensive and natriuretic effect of less-sodium soy sauce containing gamma-aminobutyric acid in spontaneously hypertensive rats”, Biosci Biotechnol Biochem, 71 165-173 56 Yang S.Y., Lu F.X., Lu Z.X., Bie X.M., Jiao Y, Sun L.J, Yu B (2008), “Production of gamma-aminobutyric acid by Streptococcus salivariussubsp thermophilus Y2 under submerged fermentation”, Amino Acids, 34 473-478 57 Zhang G., Bown A.W (1997), “The rapid determination of γ-aminobutyric acid”, Phytochemistry, 44 1007-1009 58 62 59 60 61 63