Nghiên cứu quy trình sản xuất γ aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng lactobacillus

Ngoài ra cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích miễn dịch ổn định ở Việt

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Tất Cường là

người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Sinh học làm

cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014

Học viên

Lý Thị Kim Tuyến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA) 3

1.2 Cấu trúc và hình dạng của GABA 3

1.3 Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não 4

1.4 Enzym tổng hợp GABA 5

1.5 Thụ thể GABA 6

1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật 7

1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA 9

1.8 Thực phẩm chức năng GABA 10

1.8.1 Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA 10

1.8.2 Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam 10

1.9 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 NGUYÊN LIỆU 14

2.1.1 Vi sinh vật 14

2.1.2 Các mẫu cám gạo 14

2.1.3 Các dòng tế bào 14

2.1.4 Máy móc và dụng cụ 14

2.1.5 Các hóa chất, nguyên liệu khác 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo 15

2.2.1.1 Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1 15

2.2.1.2 Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1 16

2.2.1.3 Đánh giá chất lượng cám gạo 16

2.2.1.4 Xác định hoạt tính của glutamate decacboxylase trong cám gạo 19

2.2.1.5 Xác định glutamic axit bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) 19

2.2.1.6 Định lượng glutamic acid bằng phương pháp so màu 19

2.2.1.7 Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phương pháp nước sôi 20 2.2.1.8 Xác định GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41] 20

2.2.1.9 Định lượng GABA bằng phương pháp so màu [57] 21

2.2.1.10 Xác định nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men 22

2.2.1.11 Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trường dịch cám gạo 23 2.2.2 Tinh chế GABA [31] 24

2.2.2.1 Khử màu 24

2.2.2.2 Khử muối 24

2.2.2.3 Chạy sắc ký trao đổi ion 24

2.2.2.4 Kết tinh GABA 25

2.2.3 Đánh giá hoạt tính GABA 25

2.2.3.1 Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12 25

2.2.3.2 Đánh giá khả năng sống chết của tế bào 26

2.2.3.3 Xác định GABA bằng phương pháp HPLC [42] 26

2.2.3.4 Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49] 26

2.2.3.5 Định lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo 29

3.1.1 Khả năng sinh GABA của chủng KC1 29

3.1.2 Các chỉ tiêu chất lượng và an toàn thực phẩm của cám gạo 29

3.1.3 Đánh giá hoạt động của GAD trong cám gạo 30

3.1.4 Xác định thành phần và lựa chọn nguyên liệu cám gạo 31

3.1.4.1 Xác định định tính glutamic acid trong hai mẫu cám gạo 31

3.1.4.2 Định lượng glutamic acid trong hai mẫu cám gạo 32

3.1.5 Lượng glutamic acid thu được bằng phương pháp nước sôi 34

3.1.6 Đường chuẩn GABA xác định hàm lượng GABA bằng phương pháp so màu 35

3.1.7 Nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men 36

3.1.8 Các điều kiện lên men thích hợp trên môi trường dịch cám gạo 40

3.1.8.1 pH thích hợp cho lên men 40

3.1.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho lên men 41

3.1.8.3 Thời gian thích hợp cho lên men 42

3.1.8.4 Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men 43

3.1.9 Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo 45

3.2 Đánh giá hoạt tính của GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 46

3.3 Đánh giá hoạt tính của GABA 47

3.3.1 Đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12 47

3.3.2 Xác định GABA bằng HPLC 48

3.3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của GABA thông qua thụ thể 52

3.3.3.1 Nuôi cấy tế bào WSS-1 52

3.3.3.2 Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào WSS-1 53

3.3.3.3 Định lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot 54

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Cấu trúc của GABA 4

Hình 2 Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA 5

Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA 6

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB 7

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA 7

Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trường MRS 29

Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo được xác định thông qua MSG 31

Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC 32

Hình 9: Đường chuẩn glutamic acid 33

Hình 10: Hiệu quả nhiệt độ và thời gian đối với quá trình thủy phân glutamic acid từ cám gạo 35

Hình 11: Đường chuẩn GABA 36

Hình 12: Hiệu quả của NaCl trên quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA 37

Hình 13: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 41

Hình 14: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 42

Hình 15: Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 43

Hình 16: Ảnh hưởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 44

Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo 45

Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B) 46

Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC 46

Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng

Lactobacillus-plantarum KLEPT 48

Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn 49

Hình 22: Xây dựng đường chuẩn GABA qua HPLC 49

Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men 50

Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột 51

Hình 25: Đưa mẫu GABA tinh sạch vào đường chuẩn để xác định độ tinh sạch của mẫu 52

Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dưới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy tế bào WSS-1 (A), sau 48 giờ (B) 53

Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên men 54

Hình 28: Đường chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bước sóng 405nm 55

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Thành phần môi trường MRS 15

Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng của hai mẫu cám gạo 30

Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo 33

Bảng 5: Lượng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon 38

Bảng 6: Lượng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ 39

Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hưởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi trường 40

Bảng 8: Hàm lượng GABA trong dịch lên men theo hai phương pháp đo 55

MỞ ĐẦU

γ-Aminobutyric axit (GABA) là một axít amin có chức năng quan trọng trong

hệ thống thần kinh GABA thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua khe xináp và giữ liên lạc các tế bào với nhau trong hệ thống thần kinh trung ương Ngoài ra, GABA đã được biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần kinh giống như bệnh Parkinson, Huntington và bệnh Alzheimer Chính vì GABA có những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tương bằng vi sinh vật Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới Đặc biệt, vi khuẩn axít lactic đã được ứng dụng để lên men cho hàm lượng lớn GABA từ thực phẩm truyền thống và đã tối ưu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với mục tiêu công nghiệp

Tại Việt Nam, có thể nói chưa có công nghệ chế biến GABA có khả năng hướng tới quy mô công nghiệp Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất GABA đã được nghiên cứu nhưng vẫn chưa có sản phẩm GABA bán ra thị trường Ngoài ra cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn

Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích

miễn dịch ổn định ở Việt Nam

Hiện nay, hướng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam Thực tế, khi một sản phẩm có thể tiếp cận được trên thị trường thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lượng và giá thành Để giải quyết hai vấn đề lớn này, hướng nghiên cứu của đề tài là chọn một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có nhất ở trong nước mà vẫn cung cấp được đầy đủ các thành phần cơ bản để có thể lên men được GABA có hiệu suất cao

Về chất lượng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài đã sử dụng chất chỉ thị chỉ ra được sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào

Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo

bằng Lactobacillus”

Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu:

+ Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng

chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ

+ Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA)

GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao như khoai tây, đậu tương, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi

Trong cơ thể, GABA được phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ương vào khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhưng đến năm 1960, GABA mới được đề xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể Ngoài não, GABA cũng có mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa GABA có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5] Hoạt động của GABA cùng với glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ thống thần kinh trung ương [20, 51]

Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con người:

- Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn

- Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và hiện tượng mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân Trong những trường hợp này,

bổ sung thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần kinh tại não bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân

- Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự đau nhức Như một chất dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng đau nhức kéo dài khi giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho chúng ta bớt cảm giác về sự đau nhức đó

- Giảm trầm cảm

- Việc sử dụng các loại thuốc an thần làm giảm lượng GABA trong cơ thể

và là một trong các nguyên nhân gây ra hiện tượng hoảng loạn

- GABA cũng được coi là có thể điều trị được trạng thái rối loạn tâm lý trước thời kỳ kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) đối với phụ nữ

1.2 Cấu trúc và hình dạng của GABA

GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin nhận proton (hình 1) Hình dạng của GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện của môi

trường Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo ra sức hút điện tích giữa hai nhóm chức năng amin và cacbon Theo tính toán hóa học để phá vỡ cấu trúc này cần một năng lượng khoảng 50 kcal/mol Ở trạng thái rắn, GABA luôn có hình dạng mạch thẳng Dưới dạng mạch thẳng, GABA luôn có cấu trúc hình học trans ở nhóm amin cuối và dạng cis ở nhóm cacbon kết thúc Cấu trúc này sẽ giúp cho phân tử GABA liên kết dễ dàng với các phân tử GABA khác Ở trạng thái lỏng, GABA tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có nhiều chức năng sinh học quan trọng [20, 22]

Hình 1: Cấu trúc của GABA [58]

1.3 Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não

GABA tham gia vào nhiều quá trình của hệ thống thần kinh trung ương Chẳng hạn như liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA không thể xuyên qua được hàng rào để vào trong não Do vậy, GABA được tổng hợp trong não bằng con đường trao đổi chất được biết là “GABA shunt” (hình 2) Giai đoạn cuối của con đường này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate bằng sự phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín hiệu thần kinh [20, 22]

Khi lượng GABA được sinh ra vượt quá ngưỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh sẽ được một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm giảm bớt [20] Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde succinic nhưng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA Ngoài ra, những chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lượng lớn GABA ở trong não [20] Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin

B6 hay còn được gọi là pyridoxal-5’-phophate được xem như một cofactor [32] Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não

Hình 2: Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]

GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các neuron thần kinh GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ương bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20]

Do vậy, GABA giúp cho thư giãn thần kinh và cải thiện được tinh thần Cho tới nay, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con người

có giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài, rối loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trước thời kỳ kinh nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54]

1.4 Enzym tổng hợp GABA

L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO2 GAD tồn tại dưới hai dạng đồng phân là GAD65 và GAD67 theo khối lượng phân tử của chúng (lần lượt là 65 và 67 kDa) Chúng được mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số

10 ở người, gen GAD65 nằm trên NST số 10 và gen GAD67 nằm trên NST số 2 [20, 40] GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic trong cơ thể Ngược lại, GAD65 chủ yếu được tìm thấy ở tận cùng các dây thần

kinh và nó có thể được neo trên màng của các túi chất dẫn truyền thần kinh Hoạt

động của enzym GAD cần một cofactor là pyridoxal phosphate (PLP) [52]

1.5 Thụ thể GABA

Thụ thể GABA bao gồm: thụ thể GABAA là phần phức hệ mang kênh ion và vị trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể protein G có nhiệm vụ mở kênh ion thông qua truyền thông tin nội bào qua protein G [20, 39]

Thụ thể GABAA là một phân tử lớn có 5 tiểu đơn vị protein Tất cả các tiểu đơn vị này đều có đoạn cuối là N ở phần bên ngoài tế bào, tiếp đến là 4 đoạn xuyên màng, ở đoạn xuyên màng 3 và 4 có một đoạn loop lớn, cuối cùng là đoạn cuối C ngắn Các tiểu đơn vị protein này tổ hợp bằng những con đường khác nhau và được sắp xếp tạo ra một lõi cho phép kênh Cl- đi qua (Hình 3) GABAA có vai trò cơ bản

trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hưởng tới trí nhớ ở não Các tế bào thần kinh sản xuất ra GABA được gọi là các thần kinh GABAergic và hoạt động chính trong quá trình ức chế ở các động vật có xương sống trong giai đoạn trưởng thành [39] 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hết các hoạt tính sinh lý của GABA được tạo thành thông qua thụ thể GABAA Trong động vật có xương sống, GABA hoạt động ở các khe xináp trong não bằng liên kết với thụ thể GABA xuyên màng tế bào thần kinh Quá trình liên kết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép kênh ion mang điện tích âm Cl- đi vào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích dương ra ngoài tế bào Quá trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị trí này thường xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [20]

Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA [59]

Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị là GABAB1 và GABAB2 (Hình 4) GABAB1

có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABAB2 có nhiệm vụ ở trên màng tế bào và truyền tín hiệu Thụ thể GABAB được ứng dụng như là đích để tìm các loại thuốc trong điều trị dược học và liên quan đến vai trò truyền tín hiệu về khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm [20]

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59]

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA [52] 1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật

Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD [11, 8], tách

chiết từ các loại ngũ cốc [24, 27], tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm cho hàm lượng GABA gần 15,8 g/100 g gạo [36], kích thích GAD trong mầm gạo để có thể

chuyển hóa GABA đạt hiệu suất là 29 g/100 g mầm gạo [36] hoặc lên men đậu

tương bằng vi sinh vật [9, 11, 37, 55] Công nghệ sử dụng các vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic là một phương pháp tốt để sản xuất GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45,

47, 53]

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đã được rất nhiều nghiên cứu gần đây chứng minh có khả năng sản xuất GABA [24] Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào mục đích chăm sóc sức khỏe cho con người [10, 15, 23, 29, 30, 34] Do vậy, GABA được sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và an toàn cho sức khỏe như làm tăng lượng GABA trong nước ép dâu [8] Nhiều sản phẩm được làm tăng hàm lượng GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic được phân lập từ sản phẩm của bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] và những sản phẩm lên men từ cá [26] Một vài chủng sản xuất GABA đã được chứng minh có tiềm năng sản xuất GABA ở quy mô lên men với thể tích lớn [28] Chẳng

hạn, chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc [32] đã thu được nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 1005,8 mM Leuconostoc

NC5 phân lập từ sản phẩm lên men của tôm Malaysia cho nồng độ GABA là gần

800 mM [6] Đặc biệt, chủng Latobacillus sakei B2-16 được phân lập từ kim chi

Hàn Quốc đã có khả năng lên men GABA từ dịch chiết cám gạo với nồng độ 660

mM [28] Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể

mở ra một triển vọng mới về quá trình sản xuất GABA

Ngoài ra, một số vi sinh vật khác cũng có khả năng sinh GABA đã được ứng dụng chẳng hạn như vi khuẩn kỵ khí đã sản xuất GABA trong các loại chè như chè mầm tươi, chè đen, chè Gabaron, chè olong, chè xanh [5]

Lactobacillus (viết tắt là Lb) là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic, là những

trực khuẩn không sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn gram dương Trình tự gen

GAD được tìm thấy trong Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii subsp Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25], và Lactococcus lactis subsp Lactis [34]

Trong các thập kỉ qua, các nghiên cứu cơ bản mở ra một lĩnh vực nghiên cứu mới đối với các chất có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc

từ thực phẩm.Việc sử dụng các chủng trên trong lên men tổng hợp GABA đã được nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong thực tế Hiện nay, việc lên men

Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dư thừa của

nông nghiệp đang là một hướng mới đầy tiềm năng Hoạt động của GAD trong

Lactobacillus plantarum giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp của môi trường

Sau khi hấp thụ L-glutamate từ các transpoter đặc hiệu, GAD sẽ xúc tác phản ứng decarboxyl hóa L-glutamate trong tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ một proton trong tế bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi L-glutamate thành GABA kiềm hơn [25, 14]

1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA

Monosodium glutamate (MSG) được xem như là một cơ chất trong quá trình sản xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28] MSG là một dạng muối của glutamic axit MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà được tìm thấy trong đa số các thực phẩm Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lượng protein cao chẳng hạn như bơ, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau Trong thực phẩm thường sử dụng MSG để tạo ra vị đã được biết tới khoảng 1200 năm về trước Với

vị đặc biệt của MSG đã có tên là “ Unami” trong người dân Nhật Bản Nó đã có mặt trên thị trường cách đây hơn 100 năm Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hương vị bằng cho thêm MSG với hàm lượng cao Trong sữa của các bà mẹ thì hàm lượng MSG chiếm tỉ lệ cao nhất so với các axit amino MSG trong một số loại thuốc cao cấp đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở chuột cống mới sinh Tuy nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã không xảy ra trong thực phẩm có MSG Ngoài ra, dựa vào vô số những chứng minh khoa học cũng đã công bố MSG

là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con người mà nó có vai trò như một phân tử truyền tín hiệu không chỉ ở trong thần kinh mà còn ở một số các mô khác Tuy nhiên, nếu quá trình tích lũy MSG vượt quá ngưỡng trong các khe xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn tới phá hỏng hoặc làm

tổn thương tới tế bào Hơn nữa, MSG đã có nhiều công bố là gây độc cho tế bào thần kinh ở trẻ em dưới 5 tuổi Bởi vậy, sử dụng MSG như là một cơ chất cho quá trình chuyển hóa thành GABA là một điều đáng được quan tâm [60]

1.8.1 Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA

Trong cám gạo có chứa nhiều chất quan trọng như: vitamin E, vitamin B1, B3, B6, ma-giê, man-gan, sắt, GAD và chất xơ mà thành phần chủ yếu là các polysaccharide [1, 7, 12, 13, 11] Cám gạo còn được chứng minh có thể làm giảm nguy cơ ung thư, giảm cholesterol và tốt cho hệ tim mạch của phụ nữ sau mãn kinh Đồng thời, với chất xơ trong cám gạo giúp chống lại bệnh xơ vữa động mạnh, giảm nguy cơ mắc bệnh tim và bệnh tiểu đường Mặc dù vậy, cám gạo không thể là thực phẩm cho con người vì không cho vị giác ngon nên không thể ăn hàng ngày với một lượng lớn cho mục đích tăng cường hệ miễn dịch Chính vì vậy, đã có một số công trình nghiên cứu cám gạo như là một nguồn sản xuất GABA Tuy nhiên, với những điều kiện tối ưu để làm tăng cường quá trình hoạt động của GAD trong cám gạo thì cũng chỉ cho hàm lượng GABA là 29 g/100 g cám gạo [36] Ngoài ra, một công bố

gần đây của nhóm nghiên cứu Hàn Quốc đã sử dụng Lactobacillus để lên men dịch

cám gạo đã cho hiệu suất lên men GABA là 660 mM trong dịch lên men từ 1 kg cám gạo đã được bổ sung thêm 10 lít nước và 12% MSG tương đương với 679

g/1kg cám gạo [28]

1.8.2 Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam

Tại Việt Nam, cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về GABA như tách chiết GABA từ đậu tương hoặc dự án cấp nhà nước năm 2007 về nghiên cứu

công nghệ sản xuất một số thực phẩm chức năng giàu GABA phòng chống bệnh nhân ung thư do Viện Công nghệ Thực phẩm chủ trì Tuy nhiên, khả năng ứng dụng sản xuất ở mức quy mô công nghiệp vẫn chưa hiệu quả vì sử dụng nguồn nguyên liệu đắt tiền do đó giá thành còn cao Hơn nữa, sản phẩm tạo ra để ứng dụng vào thực phẩm chức năng đang còn hạn chế về phương pháp kiểm tra hoạt tính sinh học Trong khi đó, một số công ty dược của Trung Quốc đang bán GABA với giá chỉ khoảng 400.000 đồng/kg Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào sử dụng cám gạo như một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất GABA Trong khi đó, nguồn nguyên liệu lên men từ cám gạo trong nước rất dồi dào, giá thành thấp và gần như chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc Do vậy, đây là một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất GABA có giá thành thấp

1.9 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể

Trong cơ thể, tế bào có rất nhiều quá trình sinh hóa thiết yếu cho sự sống và hoạt động chức năng được điều hòa bởi các chất dẫn truyền thần kinh và nhiều phân

tử “tín hiệu” khác Sự điều hòa bởi những chất như vậy được thực hiện thông qua các tương tác giữa các phân tử có nguồn gốc tự nhiên này với các thụ thể gắn trên màng tế bào (các thụ thể liên kết màng tế bào) hoặc có mặt trong tế bào chất (thụ thể hòa tan) hoặc trong nhân tế bào (thụ thể nhân tế bào) Trong các loại thụ thể của

cơ thể, thụ thể GABA thuộc họ thụ thể G protein là những thụ thể màng tế bào, có những phân tử nhận dạng cấu tử ở bên ngoài tế bào và kích hoạt những con đường truyền tín hiệu ở bên trong tế bào Thụ thể GABA được biết tới có khả năng chi phối nhiều loại bệnh và cũng là đích chữa bệnh của gần 30% các loại thuốc y học hiện đại hiện nay có mặt trên thị trường Trong các chương trình sàng lọc nhanh các hợp chất có hoạt tính sinh học dựa trên các protein thụ thể, được tiến hành phân tích

sự tương tác trực tiếp của hàng loạt các hợp chất mới (hoặc có nguồn gốc tổng hợp, hoặc có nguồn gốc tự nhiên) với các protein thụ thể đích được quan tâm nghiên cứu

Từ kết quả phân tích này, các hợp chất có hoạt tính tương tác đặc hiệu với các thụ thể đích mạnh thường được xem là các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng, và tiếp tục được đưa vào các chương trình đánh giá hoạt tính sinh học của chúng ở cấp

độ tế bào hoặc cơ thể Trong thực tế, các phép thử sinh học tương tác với các protein thụ thể đã là một bước ngoặt về mặt công nghệ trong việc phát hiện và thiết

kế các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm năng mới, đặc biệt là cung cấp các thông tin về mối quan hệ “hoạt tính sinh học - cấu trúc hóa học” của các hợp chất Các phương pháp tương tác thụ thể cho phép đánh giá, phân tích một lượng rất nhỏ một hợp chất hoặc dịch chiết mới (chỉ cần ở hàm lượng thấp từ 5 mg đến 10 mg) về khả năng tương tác trực tiếp của chúng với các mục tiêu dược lý ở cấp phân tử [59] Các phương pháp đang được sử dụng rộng rãi ở nước ta đều dựa trên cơ sở sử dụng các chất gắn phóng xạ theo nguyên tắc đánh giá cạnh tranh Các phương pháp này có các ưu điểm là tính đặc hiệu và độ nhạy cao, đồng thời không làm thay đổi ái lực tương tác giữa các chất gắn với protein thụ thể, nhưng cũng bộc lộ nhiều hạn chế chẳng hạn như: nguy cơ phơi nhiễm phóng xạ và ảnh hưởng đến sức khỏe, cộng đồng và môi trường xung quanh, cần chi phí cao cho thiết kế và xây dựng phòng thí nghiệm đảm bảo an toàn phóng xạ, trang thiết bị phân tích phóng xạ và nguyên vật liệu có giá thành cao Hiện nay, một phương pháp khác không sử dụng đồng vị phóng xạ đó là dùng chất gắn đặc hiệu huỳnh quang bởi fluorescein trên mô hình ở thụ thể đích Phương pháp này đã được sử dụng khá phổ biến trên thế giới và có độ chính xác cao Với phương pháp này, thì hoàn toàn có thể tiếp cận được một phương pháp sàng lọc mới hiện đang sử dụng rất nhiều ở trên thế giới là High throughput screening Đây là một quá trình thí nghiệm khoa học đặc biệt được sử dụng trong khám phá ra các loại thuốc và liên quan tới lĩnh vực sinh học và hóa học High throughput screening cho phép nhà nghiên cứu đánh giá nhanh hàng triệu điều kiện về kiểm tra dược học di truyền, hóa học Thông qua quá trình này có thể nhận dạng nhanh các hợp chất có hoạt tính, kháng thể và gen tham gia điều khiển con đường phân tử sinh học cụ thể Những kết quả của phương pháp này sẽ giúp cho quá trình khởi đầu tạo ra những loại thuốc mới và hiểu quá trình tương tác hoặc vai trò của quá trình sinh hóa trong sinh học Trong hoàn cảnh hiện nay của Việt Nam, để phát triển phương pháp đánh dấu phóng xạ là rất khó khăn Do vậy, việc phát triển phương pháp đánh dấu huỳnh quang hoặc đánh giá các tín hiệu thứ cấp

khi thụ thể hoạt động sinh ra hoàn toàn có thể phát triển và ứng dụng được trong điều kiện thực tế của Việt Nam hiện nay [17]

Bên cạnh đó, xây dựng các hệ thống sàng lọc đơn giản hóa và tự động cần được thiết lập trong các phòng thí nghiệm và tránh việc sử dụng các chất phóng xạ Hơn nữa, các hệ thống sàng lọc này sẽ cho phép phân biệt chức năng đơn giản giữa các chất chủ vận, các chất đối vận và có khả năng ứng dụng cho phần lớn các thụ thể Do vậy, phương pháp sàng lọc chức năng đối với thụ thể GABA đã phát triển gần đây dựa vào quá trình thay đổi kênh Cl- bên trong tế bào khi thụ thể này liên kết với GABA Từ quá trình thay đổi kênh Cl- sẽ bắt mầu với Iot Do vậy, việc đánh giá tín hiệu thay đổi màu Iot có thể bắt được bằng bước sóng hấp phụ 405 nm Phương pháp sàng lọc này có thể thực hiện trong những đĩa microplate với số lượng giếng là

96, 384, 1536, 3456 [17] Đây là một phương pháp được chúng tôi lựa chọn xây dựng để đánh giá hoạt tính và định lượng GABA trong đề tài nghiên cứu

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Vi sinh vật

Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) được cung cấp bởi Phòng Thí

nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên

2.1.2 Các mẫu cám gạo

Cám gạo Thái Bình (giống lúa BC15) và cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long

(giống lúa OM4900) mua trực tiếp từ người nông dân sau khi xay xát, để nguội và

đóng gói

2.1.3 Các dòng tế bào

Dòng tế bào WSS-1 có vectơ tái tổ hợp thụ thể GABA mua từ ATTC của Mỹ

Dòng tế bào P12 là dòng tế bào thần kinh chuột nhắt trắng Swiss được cung

cấp bởi Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên

2.1.4 Máy móc và dụng cụ

Máy đo OD, máy đo pH, máy khuấy từ, máy ly tâm, tủ hút, tủ đẩy, máy đọc

đĩa ELISA, máy lắc ổn nhiệt, máy đông khô, HPLC (Simazu) cùng nhiều thiết bị

khác của phòng enzym học và phân tích hoạt tính sinh học

2.1.5 Các hóa chất, nguyên liệu khác

Agar, peptone, cao nấm men, glucose, cao thịt, CH3COONa, Tri ammonium

citrate, MgSO4, Monosodium glutamate (MSG), Tween, CaCO3, Sucrose, Borate,

2-mercaptoethanol, butanol, axít acetic, ninhydrin, methanol, acetonitrile, LaCl3,

o-phthaldialdehyd, 1-butanol, K+pyrophosphate, ß-Nicotinamide adenine, NaCl,

dinucleotide phosphate hydrate, GABASE, α-ketoglutarate, NaI, GABA chuẩn,

kháng sinh (Sigma, Mỹ) DNAzol® Direct (invitrogen, Mỹ), GFX PCR, Gel Band

Purification Kit (Amersham Biosciences) CellTiter 96® Aqueous One Solution

Cell Proliferation Assay, Promega, Mỹ), Triton X-100, citrate, malate, Tripsin,

2-morpholinoethanesulfonic (MES), Pyridoxal 5-phosphate (PLP), succinate, axít trichloroacetic (TCA), triethylamine, phenylisothiocyanate (Sigma, Mỹ) Fetal bovine serum (FBS), môi trường DMEM, (Invitrogen, Mỹ)

Sắc ký bản mỏng TLC (Meck), Ống Falcon các loại (50 ml, 15 ml), đĩa ELISA

96 giếng, đĩa nuôi tế bào 24 giếng, đĩa nuôi tế bào 12 giếng, đĩa petri vô trùng nuôi cấy vi khuẩn và nuôi cấy tế bào (Corning, Mỹ) Bình nghiêng nuôi cấy tế bào, đầu côn các loại (1 ml; 0,2 ml) và các ống eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tiệt trùng dùng trong nuôi cấy tế bào (1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml), Bình thủy tinh duran các loại (Inovagen, Mỹ) Màng lọc vi khuẩn (Sigma, Đức)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo

2.2.1.1 Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1

+ Pha môi trường MRS với thành phần hóa chất như bảng 1, chỉnh pH=6, bổ sung 1 lít nước cất Sau đó, môi trường được hòa tan bằng thiết bị khuấy từ (IKA, Đức), và đem đi khử trùng bằng nồi hấp (ALP, Nhật) ở 121ºC trong vòng 15 phút

+ Chủng KC1 được bảo quản ở 4o - 6oC được cấy trên đĩa petri chứa môi trường MRS có bổ sung agar theo phương pháp cấy ria, sau đó ủ ở 37oC trong 24 giờ

+ Khuẩn lạc phát triển được nhân giống cấp II với môi trường MRS lỏng trong bình tam giác 50 ml

2.2.1.2 Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1

Chủng KC1 sẽ được cấy vào môi trường MRS có bổ sung 5% MSG và lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ Dịch nuôi cấy sau khi ly tâm 1500 vòng trong 15 phút sẽ được phân tích bằng TLC để đánh giá khả năng sinh GABA

2.2.1.3 Đánh giá chất lượng cám gạo

Các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, tro tổng số, chất xơ tổng số, mảnh vật sắc nhọn được kiểm nghiệm

 Phương pháp xác định độ ẩm

Việc xác định độ ẩm của cám gạo được tiến hành theo TCVN-4326-86

+ Sấy khô chén ở nhiệt độ 100ºC, để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng chén + Lấy 100 g cám gạo cho vào chén cân đã sấy khô, cân trọng lượng chén với mẫu (S1) trước khi cho vào sấy

+ Cho chén với mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-105ºC trong khoảng 6-8 giờ để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, cân đến trọng lượng mẫu không đổi (S2) + Tính độ ẩm: S1 - S2 (g)

 Phương pháp xác định hàm lượng protein

Việc phân tích xác định hàm lượng nitơ trong cám gạo được áp dụng theo

phương pháp Kjeldahl cho phép xác định hàm lượng protein thô

 Phương pháp xác định hàm lượng lipid

+ Sấy cốc nhôm ở nhiệt độ 100-105°C trong thời gian 2-3 giờ Gắp cốc vào bình hút

ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng và cân trọng lƣợng cốc (B)

+ Cân 100 g mẫu cho vào ống cân mẫu (ống bằng giấy để chiết suất mỡ), đặt lên trên mẫu một lớp bông đã khử mỡ và lắp vào ống mẫu Lắp toàn bộ ống mẫu vào bộ chƣng

cất mẫu

+ Đổ khoảng 70 ml ete-petrol có nhiệt độ sôi 40-600°C vào cốc chƣng cất và lắp cốc

vào bộ chƣng cất mẫu

+ Chƣng cất mẫu trong thời gian 45-60 phút

+ Sau đó lấy cốc chƣng cất ra và sấy ở nhiệt độ 100-105°C trong thời gian 30 phút

+ Gắp cốc chƣng cất có mỡ vào bình hút ẩm để nguội và cân trọng lƣợng cốc và mỡ thu

+ Cân 100 g cám với độ chính xác 0,001 g trong cốc nung đã chuẩn bị

+ Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C đến khối lƣợng khối lƣợng không đổi

+ Nung ở nhiệt độ 525°C cho đến khi thu đƣợc tro màu trắng ngà

+ Làm nguội trong bình hút ẩm

+ Quá trình nung đƣợc lặp lại cho đến khi cốc nung có khối lƣợng không đổi

+ Tính kết quả: X = m2 - m1 (g)

X: Hàm lượng chất tro

m1: Khối lượng cốc nung (g)

m2: Khối lượng cốc nung và tro (g)

 Phương pháp xác định hàm lượng các chất xơ

+ Xơ thô là phần còn lại sau khi xử lý mẫu với dung dịch H2SO4 1,25% và NaOH

1,25%

+ Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cám gạo được sấy khô

+ Axit hóa:

- Trộn 100 g mẫu cám gạo với ê-te

- Sau đó chuyển vào bình cầu dung tích 600 ml

- Cho 2 g xơ ceramic vào 200 ml H2SO4 1,25% đã đun sôi và 1 giọt an-ti-foam A

- Đặt bình cầu vào nồi chưng cất có điều chỉnh nhiệt độ và đun sôi 30 phút

- Lấy bình cầu ra và lọc dung dịch qua phễu

- Tráng bình bằng 50-75 ml nuớc nóng và rửa sạch phễu

- Rửa lại bình cầu 3 lần với 50 ml nuớc và làm khô bình

- Chuyển toàn bộ cặn trong phễu sang bình cầu trở lại bằng cách bịt ngón tay đầu dưới phễu và quay ngược để cặn rơi vào bình

+ Kiềm hóa:

- Thêm 200 ml NaOH 1,25% đã đun sôi vào bình cầu và đun sôi trong 30 phút

- Lấy bình ra và lọc như trên Rửa sạch với 25 ml H2SO4 1,25% đã đun nóng, 3 lần nuớc sôi 50 ml và 25 ml cồn

- Chuyển toàn bộ cặn sang cốc đốt khoáng

+ Khoáng hóa:

- Sấy khô 2 giờ ở 130ºC, làm nguội ở bình hút ẩm và cân

- Khoáng hóa ở 600ºC trong 30 - 60 phút, đến khi mẫu trắng đều hoàn toàn

- Làm nguội ở bình hút ẩm và cân lại

+ Hàm lượng xơ thô: Wd - Wi (g)

Trong đó: Wd: khối lượng mẫu sau sấy (g)

Wi: khối lượng sau khoáng hóa (g)

2.2.1.4 Xác định hoạt tính của glutamate decacboxylase trong cám gạo

+ 10 g cám gạo được đun ở 40ºC trong đệm 2-morpholinoethanesulfonic (MES) 0,1 M cùng với 20 μM PLP Thể tích của phản ứng là 3 ml

+ Phản ứng được thêm một dãy nồng độ MSG 5;10;20;40;80;100;200 mM hòa tan

trong 0,1 M MES, pH=5,5 ủ trong 20 phút và lắc đều

+ Kết thúc phản ứng xảy ra bằng thêm 1 ml axít trichloroacetic 8%

+ Sau đó tính hàm lượng Glutamic acid tạo thành

+ Hoạt tính của enzym này sẽ được tính toán từ đường cong giữa mối quan hệ của Glutamic acid được sản xuất và thời gian ủ với PLP

2.2.1.5 Xác định glutamic axit bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

+ Pha dung môi làm sắc ký gồm: butanol: acetic acid: nước cất theo tỉ lệ 5:3:2 và 0,04% ninhydrin

+ Chấm 2 μl dịch sau khi đã qua lọc ở trên lên bản sắc ký Sau đó để khô và nhúng

vào dung môi chạy sắc ký

+ Sau khi chạy được khoảng 10 cm tính từ điểm ban đầu thì làm khô bản sắc ký

+ Lượng glutamic acid trong các mẫu sẽ được so sánh với glutamic chuẩn

2.2.1.6 Định lượng glutamic acid bằng phương pháp so màu

 Xây dựng đường chuẩn glutamic acid

+ Pha loãng glutamic acid chuẩn ở các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8, 16 mM

+ Lấy 0,2 ml dịch lỏng trên bổ sung thêm 1 ml đệm

Thành phần đệm gồm: - 1 ml dung dịch ninhydrin 1%

- 2,4 ml dung dịch glycerol 5% v/v

- 0,2 ml citrate 0,5 M

- 100 mg/ml MnCl2 + Sau đó hỗn hợp này được lắc và đun sôi trong 12 phút

+ Làm lạnh bằng nước Sau đó đo quang phổ ở bước sóng 570 nm

 Xác định nồng độ glutamic acid trong dịch mẫu

+ Dịch cám gạo sau khi được chiết được bổ sung đệm như phương pháp xây dựng

đường chuẩn glutamic acid

+ Lấy 0,2 ml dịch lỏng trên bổ sung thêm 1ml đệm

Thành phần đệm gồm: - 1 ml dung dịch ninhydrin 1%

- 2,4 ml dung dịch glycerol 5% v/v

- 0,2 ml citrate 0,5 M

- 100 mg/ml MnCl2 + Sau đó, hỗn hợp này được lắc và đun sôi trong 12 phút

+ Sau khi thu được kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu được so sánh với đường chuẩn Dựng số liệu OD qua đường tuyến tính của glutamic acid chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của glutamic acid

2.2.1.7 Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phương pháp nước sôi

+ 100 g cám gạo đã loại bỏ phần dầu được ngâm trong 500 ml nước cất (tỉ lệ 20%) + Hỗn hợp sau đó được đem xử lý với nhiệt độ 80ºC, 90ºC, 100ºC, 110ºC, 120ºC, 130ºC, 140ºC trong thời gian 30 phút bằng nồi khử trùng (ALP, Nhật)

+ Làm lạnh trong bể đựng đá 15 phút

+ Sau đó hỗn hợp này được lọc qua giấy lọc Whatman Phần dịch lỏng thu được đem

đi phân tích hàm lượng glutamic acid

2.2.1.8 Xác định GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41]

Dịch lên men bằng vi sinh vật trên môi trường cám gạo có bổ sung 5% MSG được ly tâm và phân tích định tính GABA theo phương pháp sắc ký bản mỏng và so màu

+ Dịch lên men sau khi ly tâm 1500 vòng trong 15 phút sẽ được phân tích bằng sắc

ký bản mỏng (TLC)

+ Lấy 0,5 μl dịch chấm lên bản mỏng sắc ký để khô và nhúng vào dung dịch đệm gồm: butanol: axit axetic: nước cất theo tỉ lệ: 5:3:2 và 0,04% ninhydrin trong 4 giờ + Làm khô bằng sấy để hiện băng

2.2.1.9 Định lượng GABA bằng phương pháp so màu [57]

 Xây dựng đường chuẩn GABA

+ Pha loãng GABA chuẩn ở các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8, 16 mM

+ Bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nước trong 10 phút

+ Làm khô bằng thiết bị cô quay

+ Thêm 1 ml LaCl3 nồng độ 70 mM

+ Mẫu được lắc trong 15 phút

+ Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút

+ Lấy 800 µl dịch lỏng sau khi ly tâm chuyển sang ống eppendorf mới

+ Thêm 160 μl KOH 1 M vào dịch mới thu được, lắc đều trong 5 phút

+ Tiếp tục ly tâm trong 13.000 vòng/phút trong 5 phút

+ Lấy 550 μl dịch ly tâm + 200 μl đệm đệm K+pyrophosphat 0,5 M (pH 8,6) +

150 µl NADP 4 mM + 50 µl GABASE/ml + 50 µl α-ketoglutarate 20 mM

+ Hỗn hợp dung dịch này được đọc trên máy đo quang phổ

+ Bước sóng ban đầu đọc ở 340 nm trước khi bổ sung α-ketoglutarate

+ Sau khi bổ sung α-ketoglutarate trong 60 phút Đo lần hai với bước sóng 340 nm

 Xác định nồng độ GABA trong dịch mẫu

+ Dịch lên men sau khi đã được ly tâm, bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nước trong 10 phút

+ Bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nước trong 10 phút

+ Sau đó được làm khô bằng thiết bị cô quay

+ Thêm 1ml LaCl3 nồng độ 70 mM

+ Mẫu được lắc trong 15 phút

+ Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút

+ Lấy 800 μl dịch lỏng sau khi ly tâm sang ống eppendorf mới

+ Thêm 160 μl KOH 1 M vào dịch mới thu được, lắc đều trong 5 phút

+ Tiếp tục ly tâm trong 13.000 vòng/phút trong 5 phút

+ Lấy 550 μl dịch ly tâm + 200 μl đệm đệm K+pyrophosphat 0,5 M (pH 8,6) +

150 µl NADP 4 mM + 50 µl GABASE/ml + 50 µl α-ketoglutarate 20 mM

+ Hỗn hợp dung dịch này được đọc trên máy đo quang phổ

+ Bước sóng ban đầu đọc ở 340 nm trước khi bổ sung α-ketoglutarate

+ Sau khi bổ sung α-ketoglutarate trong 60 phút Đo lần hai với bước sóng 340 nm + Sau khi thu được kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu được so sánh với đường chuẩn Dựng số liệu OD qua đường GABA chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của GABA

2.2.1.10 Xác định nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men

 Nguồn NaCl

+ 1 lít dịch chiết cám gạo được bổ sung thêm 5% MSG

+ Bổ sung thêm NaCl với tỉ lệ lần lượt là 0, 1, 3, 5, 7% vào môi trường dịch chiết cám gạo

+ Sau đó khử trùng và điều chỉnh pH=6,5

+ Đưa thêm 1% dịch chủng gốc

+ Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, ở 34ºC, lắc với tốc độ 150 vòng/phút

+ Định lượng GABA tạo thành trong dịch lên men

 Nguồn Cacbon

+ 1 lít dịch chiết từ cám gạo được bổ sung thêm 5% MSG

+ Sau đó lần lượt bổ sung thêm 1%, 2% glucose, lactose, galactose, frutose, maltose

+ Khử trùng và điều chỉnh pH=6,5

+ Đưa thêm 1% dịch chủng gốc

+ Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, ở 34ºC, lắc với tốc độ 150 vòng/phút

+ Sau đó các mẫu được xác định hàm lượng GABA

 Nguồn Nitơ

+ 1 lít dịch chiết từ cám gạo được bổ sung thêm 5% MSG

+ Lần lượt bổ sung 0,5%, 1%, 2%, 4%, 8%, 16% cao nấm men

+ Các mẫu được khử trùng và điều chỉnh pH=6,5

+ Đưa thêm 1% dịch chủng gốc

+ Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, lắc với tốc độ 150 vòng/phút

+ Sau đó các mẫu được xác định hàm lượng GABA

 Tỉ lệ bổ sung MSG thích hợp cho lên men

1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 3%, 5%, 7%, 10%,

12%, 15% MSG Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT lên men ở điều

kiện tối ưu theo các thông số chỉ ra ở trên

2.2.1.11 Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trường dịch cám gạo

 pH thích hợp cho lên men

1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ được bổ sung 5% MSG ở các

giá trị pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 Sau đó cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT

để ở nhiệt độ 30ºC, 96 giờ cùng với tỉ lệ oxy 40% để đánh giá hiệu quả pH trong quá trình sản xuất GABA

 Nhiệt độ thích hợp cho lên men

1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ được bổ sung 5% MSG, pH=6

Sau đó cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT ở các nhiệt độ 18ºC, 22ºC, 26ºC,

30ºC, 34ºC, 38ºC, 42ºC, lên men trong 96 giờ cùng với tỉ lệ ôxy 40% để đánh gía ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên bằng dịch cám gạo

 Thời gian thích hợp cho lên men

1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6

Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong các khoảng thời

gian khác nhau: 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, và tỉ lệ ôxy 40%

 Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men

1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6

Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong 96 h, và tỉ lệ ôxy

0%, 10%, 20%, 40%, 60%

2.2.2 Tinh chế GABA [31]

2.2.2.1 Khử màu

+ Lấy dịch lên men sau khi đã được ly tâm bổ sung thêm than hoạt tính

+ Khuấy đều sau đó giữ ở 80°C trong 20 phút

+ Tiếp tục khuấy trong 10 phút

+ Lọc thu dịch

+ Dịch này cho vào đông khô và hòa lại với nước cất

2.2.2.2 Khử muối

+ Dịch này sẽ được bổ sung thêm cồn tuyệt đối

+ Giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 h

+ Lọc thu dịch và loại bỏ lượng cồn bằng thiết bị cô chân không

+ Dịch còn lại được bổ sung thêm nước cất

2.2.2.3 Chạy sắc ký trao đổi ion

 Chuẩn bị cột

+ Chuẩn bị nhựa sulfonate-polystyrene có bản chất là nhựa trao đổi cation mạnh của

hãng Sigma (IR-120 Plus) ngâm trong nước cất trong 12 h

+ Sau đó đưa nhựa trao đổi ion này lên cột

+ Tiếp tục cân bằng cột bằng HCl 1 N với tốc độ dòng chảy là 0,9 l/h

+ Rửa lại cột bằng nước cất

 Đưa mẫu lên cột

+ Mẫu được đưa với tốc độ 0,6 l/h

+ Tiếp tục rửa trôi bằng nước cất với tốc độ là 1,2 l/h

+ Tiếp tục rửa trôi bằng đệm NH3 nồng độ là 0,1 M với tốc độ 1,2 l/h

 Thôi cột

+ Thôi cột bằng NH3 nồng độ 1 M với tốc độ là 0,6 l/h

+ Dịch thôi ra được thu với các phân đoạn có thể tích là 5 ml

+ Phân tích định tính GABA ở mỗi phân đoạn thu được

+ Các phân đoạn có GABA tiếp tục được kết tinh

2.2.2.4 Kết tinh GABA

+ Các phân đoạn thu được sẽ bổ sung thêm cồn tuyệt đối

+ Sau đó để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút

+ Tinh thể GABA sẽ kết tinh ở dưới đáy

+ Lọc thu tinh thể GABA

+ Sau đó sấy tinh thể GABA ở 60°C

+ Thu lấy GABA và phân tích GABA bằng định tính

2.2.3 Đánh giá hoạt tính GABA

2.2.3.1 Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12

+ 1 ml tế bào ở trong ống được lấy ra từ Nitơ lỏng được hút ra cho vào ống fancol 15

ml có chứa 9 ml môi trường RPMI 1640

+ Tế bào thu được sẽ được phân chia đều vào đĩa 96 giếng sao cho có nồng độ 1x105

tế bào/giếng

+ Sau đó, được duy trì ở tủ nuôi cấy, sau 24 giờ

2.2.3.2 Đánh giá khả năng sống chết của tế bào

Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng sử dụng kitCellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay

+ Tế bào PC12 được ủ cùng với dịch GABA thu được sau khi nuôi cấy bằng chủng

KC1

+ Sau đó, tế bào được ủ tiếp với H2O2 (50 µM, 100 µM, 200 µM) trong 24 giờ + Sau quá trình này, 10 µl của dung dịch kit được đưa vào các giếng đã được ủ cùng với dịch lên men trong 1 giờ Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ được đo ở bước sóng 490 nm bằng máy đọc ELISA (Biorad 6860, Mỹ)

+ Giá trị hấp thụ ở 490 nm của mỗi mẫu này được tính như tỉ lệ phần trăm so với mẫu không được xử lý với GABA và H2O2 (xem như 100% tế bào sống)

acetonitrile và methanol tỉ lệ 46:44:10 (v/v), pH 7.2

+ Chạy mẫu theo gradient và phân tích kết quả thu được

2.2.3.4 Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49]

+ Tế bào WSS-1 được chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ

+ Loại bỏ môi trường và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nước cất) cho mỗi giếng

+ Thêm 10 μM GABA chuẩn, 10, 20, 30, 40 μM dịch lên men vào giếng Ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

+ Loại bỏ môi trường, bổ sung đệm phá tế bào 100 µl (1% Triton X-100, pha trong nước cất)

+ Đem đo ở bước sóng 405 nm

2.2.3.5 Định lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot

 Xây dựng đường chuẩn GABA

+ Tế bào WSS-1 được chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ

+ Loại bỏ môi trường và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nước cất) cho

 Xác định hàm lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot

+ Tế bào WSS-1 được chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ

+ Loại bỏ môi trường và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nước cất) cho mỗi giếng

+ Thêm dịch GABA lên men vào giếng Ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng