Nghiên cứu quy trình sản xuất γ aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng lactobacillus

i LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Trịnh Tất Cường là người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Sinh học làm cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN. Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014 Học viên Lý Thị Kim Tuyến ii MỤC LỤC M U 1 U 3 1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA) 3 1.2. Cng ca GABA 3 1.3. ng h 4 1.4. Enzym tng hp GABA 5 1.5. Th th GABA 6 1.6. Sn xut GABA t vi sinh vt 7 1.7. t tham gia sn xut GABA 9 1.8. Thc phm ch 10 1.8.1. o - nguu to thc phm cha GABA 10 1.8.2. u v GABA  Vit Nam 10 1.9.  th 11  14 2.1. U 14 2.1.1. Vi sinh vt 14 2.1.2. o 14 2.1.3.    14 2.1.4. ng c 14 2.1.5.  14 2.2. U 15 2.2.1. n xut GABA t do 15 2.2.1.1. o qun chng KC1 15 2.2.1.2. Kim tra kh a chng KC1 16 2.2.1.3. o 16 2.2.1.4. nh hoo 19 2.2.1.5. nh glutamic axit bn mng (TLC) 19 iii 2.2.1.6. ng glutamic acid b 19 2.2.1.7. Chit xuo bc  20 2.2.1.8. nh GABA bn mng (TLC) [41] 20 2.2.1.9. ng GABA b 21 2.2.1.10. nh ngu 22 2.2.1.11. u kin p  ng do . 23 2.2.2. Tinh ch GABA [31] 24 2.2.2.1. Kh  24 2.2.2.2. Kh mui 24 2.2.2.3. Chy si ion 24 2.2.2.4. Kt tinh GABA 25 2.2.3.  25 2.2.3.1.  WSS- PC12 25 2.2.3.2.  ng cht ca t  26 2.2.3.3. nh GABA b[42] 26 2.2.3.4.   26 2.2.3.5. ng GABA ds  27 : KT QU O LUN 29 3.1. n xut GABA t do 29 3.1.1. Kh a chng KC1 29 3.1.2.  c phm co 29 3.1.3. ng co 30 3.1.4. a cho 31 3.1.4.1. o 31 3.1.4.2. ng glutamic acid trong hai mo 32 3.1.5. c b 34 3.1.6. ng chung GABA b  35 iv 3.1.7. Ngup  36 3.1.8. u king dch o 40 3.1.8.1. pH p cho  40 3.1.8.2. Nhi  41 3.1.8.3. Th 42 3.1.8.4. T l  43 3.1.9.   dch chio 45 3.2. a GABA bn mng 46 3.3. a GABA 47 3.3.1.  ng cht ca t  47 3.3.2. nh GABA bng HPLC 48 3.3.3. c c th 52 3.3.3.1. y t WSS-1 52 3.3.3.2.  bt  WSS-1 53 3.3.3.3. ng GABA d  54 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GABA Axit gamma-amino butylric GABA-T GABA transaminase GAD L-glutamate decarboxylase HTS c High throughput screening KC1 Chng Lactobacillus plantarum KLEPT ml milliliter mM millimolar MRS De Man, Rogosa, Sharpe MSG Monosodium glutamate OD M quang hc PLP Pyridoxalphosphate TCVN n Vit Nam TLC Thin layer chromatography TPCN Thc phm ch vi DANH MỤC HÌNH ẢNH  Ca GABA 4 ng tng hy ca GABA 5 a th th GABA A 6 a th th GABA B 7 ng ca th th n kt vi GABA 7 6: Kt qu chy si vi dng MRS 29 7: Ho 31  Kt qu nh glutamic acid o bng TLC 32 ng chun glutamic acid 33 u qu nhi i i vglutamic acid t go 35 ng chun GABA 36 u qu cn t n xut GABA 37 ng ca pH tn xu dch chit o 41 ng ca nhi tn xut G men dch chit o 42 ng ca thi gian tn xu men dch chio 43 ng cn xu dch chio 44  o 45 18: Sn ph (B) 46 Kim tra GABA bng TLC 46 vii   Kh  o v t   a d   ng Lactobacillus- plantarum KLEPT 48 S ca GABA chun 49 22: ng chun GABA qua HPLC 49 H23: Chy smu d 50 24: Cht bng sc k ct 51 u GABA tinh sng chu  tinh sch ca mu 52 nh chp t i sau 24 gi y t -1 (A), sau 48 gi (B) 53 t qu i OD ca Iot di n c men 54   ng chun gia n      quang t   405nm 55 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bng MRS 15 Bng 2: Ch ng ca hai mo 30 B glutamic acid cu co 33 B t  thun Cacbon 38 B t  thun Nit Bng 7: T l MSG (%)  ng ti hiu sut to GABA trong hai loi  ng 40 Bng 8: ng GABA trong d 55 1 MỞ ĐẦU -ng trong h thng thn kinh. GABA thc hiu thn kinh qua khe    i nhau trong h thng thn kinh c biu qu t s ri lon thn kinh gi nhng cht nhiu tr  n  thc phm ch. Hin xut t nhing ht t c, tu kin t ht go ny mm, hong vi sinh vt. n xut GABA bn vi sinh vt (vi khun, n c ng dng ru qu  gic bit, vi khu c ng d cho ng ln GABA t thc phm truyn thn xut GABA khi s dng vi khui vi mp.   c      GABA        Lactobacillus   Hiu ng dn gc t   thc phm chu xut hin  Vit Nam. Thc t, khi mt sn ph th tip c n phm phm bo v ch  gii quyt hai v lu c n mt nguu r tit  n cung c   u sut cao. V chng sn phm  dng cht ch th ch ra c s ion clorua  kim tra ho ca t  2 Xu     khoa hc thc ti        “ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng Lactobacillus” u thc hin nh:  sn xut GABA t do bng chng Lactobacillus plantarum t hiu su.  th GABA. [...]... đích tăng cƣờng hệ miễn dịch Chính vì vậy, đã có một số công trình nghiên cứu cám gạo nhƣ là một nguồn sản xuất GABA Tuy nhiên, với những điều kiện tối ƣu để làm tăng cƣờng quá trình hoạt động của GAD trong cám gạo thì cũng chỉ cho hàm lƣợng GABA là 29 g/100 g cám gạo [36] Ngoài ra, một công bố gần đây của nhóm nghiên cứu Hàn Quốc đã sử dụng Lactobacillus để lên men dịch cám gạo đã cho hiệu suất lên... GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ sản phẩm của bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] và những sản phẩm lên men từ cá [26] Một vài chủng sản xuất GABA đã đƣợc chứng minh có tiềm năng sản xuất GABA ở quy mô lên men với thể tích lớn [28] Chẳng hạn, chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc [32] đã thu đƣợc nồng độ GABA trong dịch. .. cho hiệu suất lên men GABA là 660 mM trong dịch lên men từ 1 kg cám gạo đã đƣợc bổ sung thêm 10 lít nƣớc và 12% MSG tƣơng đƣơng với 679 g/1kg cám gạo [28] 1.8.2 Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam Tại Việt Nam, cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về GABA nhƣ tách chiết GABA từ đậu tƣơng hoặc dự án cấp nhà nƣớc năm 2007 về nghiên cứu 10 công nghệ sản xuất một số thực phẩm chức năng giàu GABA phòng... hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên bằng dịch cám gạo  Thời gian thích hợp cho lên men 23 1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6 Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, và tỉ lệ ôxy 40%  Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men 1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG,... Nguồn NaCl + 1 lít dịch chiết cám gạo đƣợc bổ sung thêm 5% MSG + Bổ sung thêm NaCl với tỉ lệ lần lƣợt là 0, 1, 3, 5, 7% vào môi trƣờng dịch chiết cám gạo + Sau đó khử trùng và điều chỉnh pH=6,5 + Đƣa thêm 1% dịch chủng gốc + Thời gian lên men kéo dài 96 giờ, ở 34ºC, lắc với tốc độ 150 vòng/phút + Định lƣợng GABA tạo thành trong dịch lên men  Nguồn Cacbon + 1 lít dịch chiết từ cám gạo đƣợc bổ sung thêm... sung MSG thích hợp cho lên men 1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15% MSG Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT lên men ở điều kiện tối ƣu theo các thông số chỉ ra ở trên 2.2.1.11 Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trƣờng dịch cám gạo  pH thích hợp cho lên men 1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ đƣợc bổ sung 5% MSG ở các giá... dụng cám gạo nhƣ một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất GABA Trong khi đó, nguồn nguyên liệu lên men từ cám gạo trong nƣớc rất dồi dào, giá thành thấp và gần nhƣ chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc Do vậy, đây là một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất GABA có giá thành thấp 1.9 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể Trong cơ thể, tế bào có rất nhiều quá trình. .. nuôi cấy tế bào (Corning, Mỹ) Bình nghiêng nuôi cấy tế bào, đầu côn các loại (1 ml; 0,2 ml) và các ống eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml), pipet tiệt trùng dùng trong nuôi cấy tế bào (1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml), Bình thủy tinh duran các loại (Inovagen, Mỹ) Màng lọc vi khuẩn (Sigma, Đức) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo 2.2.1.1 Nuôi cấy và bảo quản... lƣợng GABA trong đề tài nghiên cứu 13 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Vi sinh vật Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) đƣợc cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên 2.1.2 Các mẫu cám gạo Cám gạo Thái Bình (giống lúa BC15) và cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long (giống lúa OM4900) mua trực tiếp từ ngƣời nông dân sau... GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41] Dịch lên men bằng vi sinh vật trên môi trƣờng cám gạo có bổ sung 5% MSG đƣợc ly tâm và phân tích định tính GABA theo phƣơng pháp sắc ký bản mỏng và so màu + Dịch lên men sau khi ly tâm 1500 vòng trong 15 phút sẽ đƣợc phân tích bằng sắc ký bản mỏng (TLC) 20 + Lấy 0,5 μl dịch chấm lên bản mỏng sắc ký để khô và nhúng vào dung dịch đệm gồm: butanol: axit . thc ti        “ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng Lactobacillus u thc hin nh:. sản xuất GABA Monosodium glutamate (MSG)  sn xut Axit gamma-aminobutyric (GABA) bng vi khun lactic [28t dng mui ca glutamic axit. .    gen    y trong Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25 Lactococcus