Xây dựng đường chuẩn GABA
+ Tế bào WSS-1 đƣợc chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ.
+ Loại bỏ môi trƣờng và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nƣớc cất) cho mỗi giếng.
+ Bổ sung lƣợng GABA vào mỗi giếng với các nồng độ nhƣ sau: 500 µM; 250 µM; 125 µM; 62,5 µM; 31,3 µM; 15,6 µM.
+ Dung dịch không cho GABA đƣợc coi là có nồng độ 0 µM. + Ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Loại bỏ môi trƣờng, bổ sung đệm phá tế bào 100 µl (1% Triton X-100, pha trong nƣớc cất).
+ Đem đo ở bƣớc sóng 405 nm.
+ Sau khi thu đƣợc các dung dịch đã xử lý nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn là đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa OD đo đƣợc và nồng độ thực tế của nồng độ GABA.
Xác định hàm lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot
+ Tế bào WSS-1 đƣợc chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ.
+ Loại bỏ môi trƣờng và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nƣớc cất) cho mỗi giếng.
28
+ Loại bỏ môi trƣờng, bổ sung đệm phá tế bào 100 µl (1% Triton X-100, pha trong nƣớc cất).
+ Đem đo ở bƣớc sóng 405 nm.
+ Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính GABA chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của GABA.
29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo
3.1.1. Khả năng sinh GABA của chủng KC1
Để đánh giá đƣợc khả năng sinh GABA của chủng KC1, chúng tôi đã tìm phƣơng pháp thích hợp để khẳng định đƣợc khả năng sinh GABA của chủng này. Dịch tế bào sau khi lên men trên môi trƣờng MRS có bổ sung MSG theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.2] đƣợc đem ly tâm. Sau khi ly tâm, 0,5 µl dịch này đƣợc chấm lên bản sắc ký mỏng cùng với GABA chuẩn đƣợc hòa tan trong dung dịch NaOH. Kết quả trên hình 6 cho thấy trên đƣờng chạy của mẫu lên men có rất nhiều chất khác nhau. Tuy nhiên, kết quả này cũng chỉ ra một vệt rất rõ và đậm có kích thƣớc gần tƣơng đƣơng với vết trên đƣờng chạy GABA chuẩn. Nhƣ vậy, trong dịch lên men đã có sản phẩm GABA sinh ra.
1 2
Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trƣờng MRS . Đƣờng 1: Dịch lên men, Đƣờng 2: GABA chuẩn
3.1.2. Các chỉ tiêu chất lƣợng và an toàn thực phẩm của cám gạo
Trƣớc khi lựa chọn cám gạo để nghiên cứu cho quá trình lên men. Cả hai mẫu cám gạo của tỉnh Thái Bình, Đồng bằng sông Cửu Long đã đƣợc chúng tôi phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng và an toàn thực phẩm theo một số tiêu chuẩn của Cục An toàn thực phẩm phát hành. Cám gạo của hai tỉnh đã đƣợc đánh giá các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, tro tổng số, chất xơ tổng số, các mảnh sắc nhọn. Đây là một trong số những chỉ tiêu đƣợc Cục An toàn thực phẩm yêu cầu kiểm tra đối với nguồn nguyên liệu ban đầu trƣớc khi đem đi chế biến. Từ
30
bảng 2 cho thấy các chỉ tiêu chất lƣợng của mẫu cám gạo tỉnh Thái Bình và cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long đều đạt ngƣỡng cho phép của Cục An toàn thực phẩm.
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng của hai mẫu cám gạo
3.1.3. Đánh giá hoạt động của GAD trong cám gạo
GABA đƣợc tổng hợp từ khử cacbon của L-glutamate bằng GAD thƣờng phụ thuộc vào lƣợng PLP. Khi hoạt tính GAD hoạt động càng mạnh thì khối lƣợng GABA tạo ra càng nhiều. Việc đầu tiên chúng tôi phải xác định điều kiện môi trƣờng tối ƣu để GAD trong cám gạo hoạt động mạnh nhất đối với quá trình sản xuất GABA. Do vậy, chúng tôi đã bổ sung một dãy các nồng độ MSG vào dịch cám gạo giống nhƣ ở phần phƣơng pháp. Sau đó bổ sung thêm các nồng độ của PLP và một số mẫu dịch cám gạo không bổ sung PLP. Các mẫu dịch cám gạo sau khi đã đƣợc ủ ở các thời gian khác nhau nhƣ phần phƣơng pháp đƣợc đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, các dịch này đƣợc xác định hàm lƣợng GABA. Từ đây, chúng tôi đánh giá đƣợc hoạt tính của GAD. Từ kết quả của hình 7 cho thấy hoạt tính của GAD phụ
STT Tên chỉ tiêu chất lƣợng
Đơn vị tính
Mẫu cám gạo
Tiêu chuẩn cho phép Thái Bình Đồng bằng
sông Cửu Long
1 Độ ẩm g/100g 11,3 12 12 2 Protein g/100g 13,7 14,1 13 3 Lipid g/100g 14,7 12,6 12 4 Tro tổng số g/100g 7,2 6,5 15 5 Chất xơ tổng số g/100g 3,4 1,0 8 7 Mảnh vật sắc
31
thuộc vào nồng độ của MSG và đạt giá trị cao nhất khi MSG có nồng độ là 100 mM, và sẽ giảm dần khi lƣợng MSG cao hơn. Từ kết quả này cũng cho thấy hoạt tính của GAD phụ thuộc vào PLP. Khi không bổ sung PLP (đƣờng hình màu đỏ) thì hoạt độ của GAD thấp hơn nhiều so với mẫu có bổ sung PLP (đƣờng hình màu xanh). Điều này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu đã đƣợc công bố trƣớc đây [34].
Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo đƣợc xác định thông qua MSG. 3.1.4. Xác định thành phần và lựa chọn nguyên liệu cám gạo
3.1.4.1. Xác định định tính glutamic acid trong hai mẫu cám gạo
Glutamic acid là một thành phần quan trọng có thể chuyển hóa thành GABA, do đó sẽ quyết định việc lựa chọn cám gạo làm dịch lên men tạo thành GABA. Vì vậy chúng tôi đã xác định định tính glutamic acid trong cả hai mẫu cám. 100 g cám gạo đã loại bỏ dầu đƣợc tiến hành phân tích glutamic acid theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.4]. Dịch sau khi đƣợc chiết xuất bằng phƣơng pháp nƣớc siêu tới hạn đƣợc đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó dịch này đƣợc thu lại và tiến hành chạy sắc ký bản mỏng nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả thu đƣợc chỉ ra ở hình 8. Từ kết quả này, chúng tôi thấy cả hai mẫu cám gạo đều có glutamic cid. Tuy nhiên, về mặt định tính cho thấy lƣợng glutamic acid ở cám gạo Thái Bình là nhiều
250 200 150 1 50 100 6 5 4 3 2 7 Hoạt tính của GAD (μmol/min/g) MSG (mM) 0 Mẫu bổ sung PLP Mẫu không bổ sung PLP
32
hơn theo đƣờng chạy số 1, lƣợng glutamic acid ở trong cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long là rất ít theo đƣờng chạy số 3.
Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC Đƣờng 1: Mẫu cám gạo Thái Bình. Đƣờng 2: Glutamic acid chuẩn. Đƣờng 3: Mẫu cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long
3.1.4.2. Định lƣợng glutamic acid trong hai mẫu cám gạo
Đường chuẩn Glutanic acid
Để tìm ra đƣợc các thông số lên men tối ƣu và đánh giá đƣợc hiệu quả của quá trình lên men thì việc định lƣợng đƣợc hàm lƣợng glutamic acid là rất quan trọng. Việc định lƣợng glutamic acid sẽ thông qua việc xây dựng đƣờng chuẩn dựa vào sự thay đổi khả năng hấp thụ quang học của các nồng độ glutamic acid khác nhau. Lƣợng glutamic acid đƣợc pha ở các nồng độ theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.6]. Sau đó, các mẫu này đƣợc đo mật độ quang thực hiện theo nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả trên hình 9 cho thấy ứng với mỗi một nồng độ khác nhau của glutamic acid sẽ đo đƣợc một mật độ quang tƣơng ứng. Trên dữ liệu này, ứng dụng phần mềm Xcell đã xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn glutamic acid với hai thông số nồng độ (mM) và mật độ hấp thụ quang học tƣơng ứng (OD) (hình 9). Dựa trên đƣờng chuẩn xây dựng này sẽ định lƣợng đƣợc lƣợng glutamic acid tạo thành.
33 Y là giá trị OD
X là nồng độ Glutamicacid (mM)
Hình 9: Đƣờng chuẩn glutamic acid
Hàm lượng Glutamic acid trong hai loại cám gạo
Sau khi hai mẫu cám gạo đã xác định đƣợc đều có glutamic acid, chúng tôi tiếp tục tiến hành định lƣợng glutamic acid trong mỗi mẫu cám gạo. Dịch chiết cám gạo của hai tỉnh Thái Bình và Đồng bằng sông Cửu Long đã đƣợc xử lý theo phần phƣơng pháp. Hai mẫu dịch đƣợc xác định hàm lƣợng glutamic acid theo phần phƣơng pháp [2.2.1.6]. Bằng phƣơng pháp so màu đã cho kết quả ở bảng 4. Lƣợng glutamic acid của tỉnh Thái Bình là 0,25 mg/g. Trong khi đó lƣợng glutamic acid trong cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long là 0,03 mg/g. Kết quả này cũng gần giống với phần định tính đã chỉ ra.
Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo
Từ kết quả phân tích định tính và định lƣợng trên, chúng tôi đã quyết định chọn cám gạo tỉnh Thái Bình làm nguyên liệu cho quá trình lên men sản xuất GABA từ cám gạo. y = 0.003x + 0.049 R² = 0.995 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 5 10 15 20
Tỉnh Thái Bình Đồng Bằng Sông Cửu Long Glutamic acid (mg/g trọng lƣợng khô) 0,25 0,03
glutamic acid (mM) OD570
34
3.1.5. Lƣợng glutamic acid thu đƣợc bằng phƣơng pháp nƣớc sôi
Phƣơng pháp này dựa vào quá trình gia nhiệt và thời gian để đánh giá hàm lƣợng glutamic acid sinh ra. Một dải nhiệt độ bắt đầu từ 80°C cho đến 140°C đã đƣợc tiến hành tại nhiều thời gian khác nhau bằng gia nhiệt trong nồi khử trùng. Dịch sau khi đã gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau tƣơng ứng với các khoảng thời gian từ 5, 10, 20, 30 phút đƣợc lấy để đánh giá hàm lƣợng glutamic acid theo phần phƣơng pháp. Kết quả đã chỉ ra ở hình 10, cả 7 điểm nhiệt độ tại thời điểm sau 5 phút đều đã chiết xuất ra glutamic acid. Tuy nhiên, điểm 140°C lại cho hàm lƣợng glutamic acid thấp nhất. Có thể vì khi ở nhiệt độ cao nên khả năng biến tính glutamic acid đã xảy ra. Ở nhiệt độ 130°C cho hàm lƣợng glutamic acid là cao nhất. Sau 10 phút, hàm lƣợng glutamic acid cao nhất vẫn xảy ra tại 130°C và thấp nhất tại 140°C, đặc biệt là điểm 120°C cũng cho lƣợng glutamic acid gần bằng so với thủy phân tại nhiệt độ 130°C. Khi thời gian kéo dài tới 20 phút chỉ có thủy phân ở nhiệt độ 130°C cho hàm lƣợng glutamic acid là cao nhất. Còn tại các nhiệt độ khác thì hàm lƣợng glutamic acid đã tăng chậm lại. Riêng đối với 80°C và 90°C và 110°C hàm lƣợng glutamic acid lại giảm đi. Tại thời điểm sau 30 phút thì lƣợng glutamic acid vẫn tiếp tục tăng tại 130°C và đặc biệt là tăng nhanh ở 120°C. Tuy nhiên lƣợng glutamic acid tại 130°C vẫn cao hơn so với hàm lƣợng này khi thủy phân ở 120°C. Từ kết quả phân tích hàm lƣợng glutamic acid ở trên cho thấy hàm lƣợng glutamic acid thu đƣợc bằng phƣơng pháp thủy phân ở nhiệt độ 130°C vẫn cho hàm lƣợng glutamic acid cao nhất là 0,24 mg/g.
35
Hình 10: Hiệu quả nhiệt độ và thời gian đối với quá trình thủy phân glutamic acid từ cám gạo.
3.1.6. Đƣờng chuẩn GABA xác định hàm lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so màu. màu.
Để tìm ra đƣợc các thông số lên men tối ƣu và đánh giá đƣợc hiệu quả của quá trình lên men thì việc định lƣợng đƣợc hàm lƣợng GABA là rất quan trọng. Việc định lƣợng GABA sẽ thông qua việc xây dựng đƣờng chuẩn dựa vào sự thay đổi khả năng hấp thụ quang học của các nồng độ GABA khác nhau. Lƣợng GABA đƣợc pha ở các nồng độ theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.9]. Sau đó, các mẫu này đƣợc đo mật độ quang thực hiện theo nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả trên hình 11 cho thấy ứng với mỗi một nồng độ khác nhau của GABA sẽ đo đƣợc một mật độ quang tƣơng ứng. Trên dữ liệu này, ứng dụng phần mềm Xcell đã xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn GABA với hai thông số nồng độ (mM) và mật độ hấp thụ quang học tƣơng ứng (OD) (hình 11). Dựa trên đƣờng chuẩn xây dựng này sẽ định lƣợng đƣợc lƣợng GABA tạo thành trong quá trình lên men.
80ºC 90ºC 100ºC 110ºC 120ºC 130ºC 140ºC phút 0,05 0,15 0,2 0,25 0,1 35 30 25 20 15 10 5 0 glutamic acid (mg/g) 0,3
36
Trong đó: Y là giá trị OD ; X là nồng độ GABA (mM) Hình 11 : Đƣờng chuẩn GABA 3.1.7. Nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men
Hiệu quả của nguồn NaCl
Vi sinh vật thƣờng sẽ cần cung cấp thêm một số nguyên tố vô cơ trong quá trình phát triển. Do vậy, việc tìm kiếm và bổ sung thêm các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng. Để cung cấp thêm nguồn vô cơ trong môi trƣờng dịch cám gạo thì lƣợng NaCl đã đƣợc điều tra. Đây là một yếu tố vô cơ thƣờng đƣợc đòi hỏi trong quá trình phát triển của tế bào vi sinh vật. Dịch cám gạo đƣợc bổ sung NaCl ở các nồng độ nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.10.1]. Sau đó, chúng tôi tiến hành lên men các dịch này với chủng KC1 ở nhiệt độ 34°C trong 96 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Dịch sau khi lên men đƣợc ly tâm tƣơng ứng với từng môi trƣờng lên men đã đƣợc bổ sung tỉ lệ NaCl khác nhau. Các dịch lên men này đƣợc đánh giá hàm lƣợng GABA và mật độ tế bào. Kết quả đã đƣợc chỉ ra ở hình 12. Nhƣ vậy, khi nồng độ NaCl cao sẽ gây ảnh hƣởng tới sự sống của tế bào. Tỉ lệ NaCl lớn hơn 1% lƣợng tế bào sẽ giảm mạnh và thậm chí tế bào không phát triển đƣợc với nồng độ NaCl 7%. Lƣợng tế bào giảm thì lƣợng GABA sinh ra cũng giảm theo với tỉ lệ NaCl tăng lên. Tuy nhiên, khi bổ sung với lƣợng NaCl 1% thì mật độ tế bào tăng lên khá mạnh so với không bổ sung. Từ các số liệu này chỉ ra với tỉ lệ 1% NaCl sẽ tạo điều kiện để chủng KC1 phát triển mạnh nhất và tƣơng ứng với sự phát triển này là hàm lƣợng GABA sinh ra cũng mạnh. R 2 = 1 0 0 4 GABA (mM) 0.06 OD340 0.02 0.01 0.05 0.04 0.03 2 8 16 y = 0.003x + 0.0069
37
Hình 12: Hiệu quả của NaCl với quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA
Hiệu quả của nguồn Cacbon
Để lên men của chủng KC1 trong môi trƣờng cám gạo cần thiết phải bổ sung thêm lƣợng cacbon để đảm bảo cho vi khuẩn phát triển mạnh từ đó sẽ có khả năng chuyển hóa GABA hiệu suất cao. Nguồn cacbon để vi khuẩn lactic phát triển có rất nhiều loại khác nhau tùy thuộc vào từng chủng. Do vậy, việc chọn nguồn nguyên liệu bổ sung cacbon ban đầu cho chủng KC1 là rất quan trọng. Một loạt các nguyên liệu có thể cung cấp bổ sung cacbon cho chủng KC1 đã đƣợc khảo sát. Cám gạo sau khi đã đƣợc xử lý phần chất béo đã đƣợc tiến hành tách chiết nhƣ phần phƣơng pháp. Môi trƣờng dịch cám gạo sau khi đƣợc ly tâm đã đƣợc bổ sung thêm riêng biệt Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manose theo các nồng độ nhƣ phần phƣơng pháp. Sau đó, các môi trƣờng này đƣợc lên men với chủng KC1 ở 34°C, trong 96 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Dịch sau khi lên men đƣợc ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, dịch đƣợc thu lại và đem xác định hàm lƣợng GABA theo phƣơng pháp. Kết quả ở bảng 5 cho thấy khi không đƣợc cung cấp thêm nguồn C thì mật độ tế bào phát triển thấp nhất và lƣợng GABA tƣơng ứng sinh ra cũng thấp nhất. Cả 5 nguồn cacbon đều cho mật độ phát triển tế bào mạnh và tƣơng ứng sinh ra một lƣợng lớn GABA. Tuy nhiên, khi bổ sung Glucose cho mật độ tế bào phát triển mạnh nhất ở 2% nhƣng lƣợng GABA sinh ra lại nhiều nhất khi Glucose bổ sung 1%.
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 NaCl 0 200 150 50 100 GABA (mM) OD600 GABA Sự phát triển tế bào
38
Bảng 5: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon