Đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12- 123docz.net

Để khẳng định GABA sinh ra đƣợc từ chủng Lactobacillus plantarum

KLEPT có hoạt tính sinh học, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính của GABA sinh ra thông qua việc đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12 (dòng tế bào đƣợc phân lập từ hệ thần kinh chuột). Sau khi tế bào PC12 đã đƣợc hoạt hóa ở tủ nuôi cấy tế bào trong 24 giờ, các tế bào này đƣợc chia vào đĩa 96 giếng và đƣợc nuôi tiếp trong tủ nuôi tế bào. Sau 24 giờ, các tế bào này sẽ đƣợc bổ sung dịch lên men có GABA. Sau 60 phút, bổ sung thêm H2O2 với nồng độ nhƣ đã chỉ ra ở phần phƣơng pháp [2.2.3.1]. Sau 24 giờ, sử dụng kit để đánh giá khả năng sống chết của tế bào sau khi đƣợc tiền xử lý và không tiền xử lý cùng với GABA. Hình 20 là kết quả sau khi đánh giá mật độ sống chết của tế bào. Từ kết quả này cho thấy ở nồng độ 20 µl/ml dịch lên men có chứa GABA thì khả năng tế bào sống đã đƣợc cải thiện hơn rất nhiều so với tế bào không đƣợc tiền xử lý cùng với dịch lên men có chứa GABA gần 90%. Với nồng độ 50 µl/ml dịch lên men có chứa GABA thì khả năng sống của tế bào đã đƣợc cải thiện gần nhƣ 100% so với tế bào không đƣợc tiền xử lý trƣớc khi ủ với H2O2. Việc đánh giá hoạt tính của GABA là rất quan trọng quyết định đến cả quá trình lên men. Bởi vì, nếu GABA sinh ra không có hoạt tính thì việc sản xuất GABA sẽ không có ý nghĩa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra đƣợc GABA sinh ra bằng chủng Lactobacillus plantarum KLEPT có hoạt tính tốt và hoàn toàn có khả năng tiếp tục nghiên cứu để tìm kiếm môi trƣờng thay thế MRS vì giá thành cao sẽ không có lợi cho việc sản xuất GABA với số lƣợng lớn.

Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng

Lactobacillus plantarum KLEPT. 3.3.2. Xác định GABA bằng HPLC

Thành phần GABA trong dịch lên men đã đƣợc chúng tôi xác định bằng phƣơng pháp so màu. Tuy nhiên, để khẳng định thêm độ chính xác của GABA tạo thành chúng tôi đã tiến hành phân tích GABA trong dịch lên men bằng phƣơng pháp HPLC. Bản thân GABA không hấp thụ ánh sáng nhìn thấy, UV hay huỳnh quang. Chính vì vậy, để phân tích đƣợc GABA bằng HPLC cần phải chuyển GABA sang một dẫn xuất có khả năng hấp thụ tốt UV hoặc vùng ánh sáng thƣờng hoặc là huỳnh quang mạnh để bắt đƣợc sản phẩm. Trƣớc tiên, GABA chuẩn đƣợc phân tích giống nhƣ phần phƣơng pháp bằng thiết bị HPLC. Sau khi chạy sắc ký cho kết quả ở hình 21. Từ sắc ký đồ thu đƣợc cho thấy GABA chuẩn sau khi đƣợc thôi bằng đệm sẽ cho một pick duy nhất sau 19 phút.

Tỉ lệ tế bào sống sót 0 50 75 100 DM - 20 50 - 20 50 - 20 50 (µg/ml ) 50 100 200 (µM)

Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn

Tiến hành chạy sắc ký GABA chuẩn ở các nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50µl chúng tôi xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn GABA trên hình 22, đƣờng chuẩn này là cơ sở xác định đƣợc nồng độ GABA trong mẫu dịch nghiên cứu.

Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC

Tiếp tục chạy sắc ký dịch lên men thô nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tôi thu đƣợc sắc ký đồ có nhiều pic khác nhau (hình 23). Tuy nhiên, sắc ký đồ vẫn cho pick giống với pick của GABA chuẩn sau 19 phút thôi cột. Điều đó cho phép chúng tôi khẳng định một lần nữa trong dịch lên men đã sinh ra GABA.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 100 200 300 400 500 mAU 358nm,4nm (1.00) 0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5

Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men

Sau khi chạy sắc ký mẫu dịch lên men thô, chúng tôi tiến hành chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột để kiểm tra độ tinh sạch của GABA trong mẫu dịch lên men, kết quả trên hình 24C chỉ còn một pick duy nhất xuất hiện ở phút 19, đó chính là pick của GABA trong mẫu lên men.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 25 50 75 100 125 150mAU358nm,4nm (1.00)

Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột

Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu dịch lên men chúng tôi chạy sắc ký mẫu lên men sau khi tinh sạch với nồng độ 20 µl và đƣa vào đƣờng chuẩn GABA, kết quả trên hình 25 cho thấy GABA trong mẫu dịch lên men sau khi tinh sạch đạt độ tinh sạch khá cao 96,7%. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 100 200 300 mAU 358nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 50 100 150 mAU 358nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 100 200 300 400 500 mAU 358nm,4nm (1.00)

Level Conc Mean Area S % RSD Area 1 Area 2

1 10 2516827 2516827 0

2 20 6154657 124699.2 2.026095 6242833 6066482

3 30 9151430 9151430 0

4 40 12149212 12149212 0

5 50 16341778 16341778 0

Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh sạch vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh sạch của mẫu

 Kết quả mẫu tinh sạch đạt độ tinh sạch cao 96,7 %

3.3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của GABA thông qua thụ thể 3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1 3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1

Việc nuôi tế bào WSS-1 phát triển là một vấn đề quyết định đến quá trình thử hoạt tính của GABA. Chính vì vậy, tế bào đã đƣợc tiến hành nuôi cấy trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt và theo phần phƣơng pháp. Sau khi tế bào đƣợc nuôi trong tủ nuôi cấy tế bào với tỉ lệ CO2 là 5%, nhiệt độ 37°C và đƣợc quan sát trên kính hiển vi. Kết quả trên hình 26A cho thấy tế bào dính kết và tăng sinh nhiều sau 24 giờ. Tỉ lệ tế bào này tiếp tục tăng sinh lên sau 48 giờ (hình 26B).

0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5

53 .

A B

Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy (A), sau 48 giờ nuôi cấy (B)

3.3.3.2. Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào WSS-1 WSS-1

Việc đánh giá hoạt tính của GABA sau khi sản xuất sẽ quyết định chất lƣợng toàn bộ công nghệ sản xuất lên men từ dịch cám gạo bởi vì nếu sản phẩm tạo ra không có hoạt tính thì sản phẩm sẽ không có ý nghĩa về dƣợc tính và sẽ không có tác động đến điều trị bệnh. Chính vì vậy, việc đánh giá hoạt tính dựa ngay vào tác động của thụ thể GABA trên dòng tế bào WSS-1 có một ý nghĩa vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã áp dụng dòng tế bào này trong việc xác định hoạt tính sinh học của dịch GABA sau khi lên men. Tế bào đƣợc phân chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng và thao tác theo phần phƣơng pháp. Tế bào trong các giếng của đĩa 96 đƣợc đem đo khả năng hấp thụ quang học ở bƣớc sóng 405 nm. Kết quả đọc đƣợc ghi lại và sử dụng phần Xcell cho kết quả ở hình 27. Từ kết quả này cho thấy, tế bào không đƣợc xử lý bằng GABA thì khả năng hấp thụ Iot là gần nhƣ bằng 0. Tuy nhiên, khi tế bào đƣợc xử lý bằng GABA chuẩn và các nồng độ GABA lên men ở dạng thô thì khả năng thay đổi màu của Iot là rất rõ ràng.

Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên men

3.3.3.3. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot

Phƣơng pháp định lƣợng GABA bằng so màu thông thƣờng cho kết quả chính xác và đã đƣợc áp dụng từ nhiều năm. Tuy nhiên, việc định lƣợng này không tác động lên đích thực sự của hoạt động tế bào. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp định lƣợng GABA trong dịch lên men bằng phƣơng pháp so màu với Iôt để từ mật độ quang thu đƣợc sẽ suy ra nồng độ GABA và đánh giá luôn đƣợc hoạt tính. Điều này có vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển thực phẩm chức năng để xác định sản phẩm có tác động thực sự lên đích của tế bào hay không. Để đánh giá đƣợc chính xác hàm lƣợng GABA đƣợc tạo thành trong dịch lên men cần phải xây dựng một đƣờng chuẩn của GABA. Dựa vào đƣờng chuẩn này sẽ đo đƣợc hàm lƣợng GABA trong dịch lên men bằng cách suy ra từ mật độ quang thu đƣợc.

 Xây dựng đường chuẩn

Một dải nồng độ GABA đã đƣợc pha nhƣ phần phƣơng pháp. Sau đó, các nồng độ này đƣợc đƣa vào đĩa có chứa tế bào WSS-1. Sau đó, các tế bào này đƣợc đem đánh giá khả năng hấp thụ màu ở bƣớc sóng 405 trên máy ELISA 6860. Kết

quả này đã cho đƣờng chuẩn GABA (hình 28). Dựa vào đƣờng chuẩn này, chúng tôi suy ra đƣợc nồng độ GABA của mẫu cần đo.

Hình 28: Đƣờng chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bƣớc sóng 405 nm

 Xác định hàm lượng GABA trong dịch lên men

Để đánh giá đƣợc độ chính xác của phƣơng pháp định lƣợng thông qua thụ thể GABA và phƣơng pháp so màu. Chúng tôi đã lấy mẫu lên men đo bằng hai phƣơng pháp. Kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 9. Từ kết quả này cho thấy hàm lƣợng GABA đo bằng cả hai phƣơng pháp là không có sự khác nhau. Nhƣ vậy, phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng GABA thông qua thụ thể có thể đƣợc áp dụng vì phƣơng pháp này so với phƣơng pháp so màu cho kết quả giống nhau ngoài ra phƣơng pháp này có khả năng đánh giá đƣợc hoạt tính của GABA trực tiếp trên tế bào.

Bảng 9: Hàm lƣợng GABA trong dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo

y = 0.0003x + 0.9097 R² = 0.9824 0.9 0.95 1 1.05 1.1 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ GABA (mM)

Phƣơng pháp đánh giá GABA (mM)

so màu thông thƣờng 672

so màu iot 670

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Đề tài đã hoàn thành với các kết quả chính nhƣ sau:

1. Quy trình lên men từ chủng Lactobacillus plantarum KLEPT trên môi trƣờng dịch cám gạo sẽ đạt hiệu quả nhất khi bổ sung thêm 1% NaCl, 1% glucose, 1% cao nấm men, 12% mỳ chính cho 10 lít dịch lên men.

2. Xác định đƣợc các thông số chính dùng lên men GABA thích hợp nhất là pH 6,5; nhiệt độ 340C; thời gian 96 h; tỉ lệ oxi 40%.

3. Đánh giá hoạt tính của GABA trực tiếp trên tế bào theo phƣơng pháp so màu Iot cho kết quả tƣơng đƣơng với phƣơng pháp so màu thông thƣờng.

Kiến nghị

1. Tiếp tục hoàn thiện phƣơng pháp tinh chế GABA bằng công nghệ kết tinh. 2. Bƣớc đầu đánh giá hiệu quả GABA trên động vật và ngƣời.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt:

1. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và kĩ thuật.

2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục. 3. Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sƣ phạm

Hà Nội.

4. Nguyễn Xuân Thắng (2002), Receptor màng tế bào và tác dụng của thuốc, NXB Y học, Hà Nội.

Tiếng anh:

5. Abe Y., Umemura S., Sugimoto K.I., Hirawa N., Kato Y., Yokoyama N. Yokoyama T., Junichi I., Masao I (1995), “Effect of green tea rich in γ - aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American Journal of Hypertens 8(1), 74-79.

6. Ali F.W.O., Abdulamir A.S., Mohammed A.S., Bakar F.A., Manap Y.A., Zulkifli A.H., Saari N (2009), “Novel, Practical and Cheap Source for Isolating Beneficial gamma-Aminobutyric Acid-Producing Leuconostoc NC5 Bacteria”,

Research Journal of Medical Science,3(4). 146-153.

7. Bautista G.M., Lugay J.C., Cruz L.J., Juliano B.O. (1964), “Glutamic acid decarboxylase activity as a viability index of artificial dried and stored rice”,

Cereal Chem, 41. 188-191.

8. Cagno R. D., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D. (2009), “Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by

Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, 86. 731-741.

9. Connor M.A., Saunders R.M., Kohler G.O. (1977), “Preparation and properties of protein concentrates obtained by wet alkali processing of rice bran”, Rice By- products Utilization International Conference, IACFT, Spain.

10.Cross M. L. (2004), “Immune-signaling by orally-delivered probiotic bacteria: Effects on common mucosal immunoresponses and protection at distal mucosal sites”, J. Immunopathol. Pharmacol, 17. 127-134.

11.Chin H.S., Breidt F., Fleming H.P., Shin W.C., Yoon S.S (2006), “Identification of predominant bacterial isolates from the fermenting kimchi using ITS-PCR and partial 16S rDNA sequence analyses”, J. Microbiol. Biotechnol,16. 68-76. 12.Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C. (2007), “Production of gamma-aminobutyric

acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells”, J. Microbiol Biotechnol, 17. 104-109. 13. Choi S. I., Lee J. W., Park S. M., Lee M. Y., Ji G. E., Park M. S., Heo T. R

(2006), “Improvement of γ-aminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis”, J. Microbiol. Biotechnol, 16. 562-568. 14. Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., De Angelis M., Giuliani G., Meloni

M., De Servi B., Gobbetti M. (2009), "Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications", Appl Microbiol Biotechnol, 86. 41- 731.

15. Foester C.W., Foester H. F. (1973), “Glutamic acid decarboxylase in spores of

Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination”, J. Bacteriol, 114. 1090-1098.

16. Hayakawa K., Masayuki K., Yamori Y. (2005), “Role of the renal nerves in γ- aminobutyric acid-induced anti-hypertensive effect in spontaneously hypertensive rats”, European Journal of Pharmacology, 524. 120-125.

17. Inglese J. (2007), “High-throughput screening assays for the identification of chemical probes”, Nature chemical biology, 3. 466-479.

18. Jannoey P., Niamsup H., Lumyong S., Tajima S., Nomura M., Chairote G. (2010), “γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulations in Rice During Germination”, Chiang Mai J, 37(1). 124-133.

19. Jeun J.H., Kim H.D., Lee H.S., Ryu B.H. (2004), “Isolation and identification of Lactobacillus sp produced γ-aminobutyric acid (GABA) from traditional salt fermented anchovy”, Kor. J. Food Nutr, 1. 72-79.

20. Jin Z., Mendu S.K., Birnir B. (2011), GABA is an effective immunomodulatory molecule, Amino Acids, 45. 87-94.

21. Kang M.S., Cho S.C., Kook M.C., Pyun Y.R., Choi C.I. (2006), “Novel strains of Lactobacillus spp and method for preparing γ-aminobutyric acid using the same”, Korea. Patent. 10-0549094.

22. Kayahara H., Sugiura T. (2001), “Research on physiological function of GABA in recent years-improvement function of brain function and anti-hypertension”,

Japanese Journal of Food development, 36(6). 4-6.

23. Kim S.H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J. (2007), “Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2”, Biotechnol Bioprocess Eng, 12. 707-712.

24. Kinefuchi M., Sekiya M., Yamazaki A., Yamamoto K. (1999), “Accumulation of GABA in brown rice by high pressure treatment”, Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 46. 323-328.

25. Komatsuzake N., Kawamoto S., Momose H., Kimura T. (2005), "Production of γ aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods", Food Microbiol, 22. 497-504.

26. Komatsuzake N., Shima J., Kawamoto S., Momose H., Kimura T. (2005), “Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods”, Food Microbial, 22. 497-504.

27. Kono I., Himeno K. (2000), “Changes in γ-aminobutyric acid content during beni-koji making”, Biosci. Biotechnol. Biochem, 64. 617-619.

28. Kook M.C. (2010), “Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16”, J. Microbiol. Biotechnol, 20(4). 763-766.

29. Lee H.Y., Park J.H., Seok S.H., Choi S.A., Baek M.W., Kim D.J., Lee Y., Park J.H. (2004), “ Dietary intake of various lactic acid bacteria suppresses type 2 helper T cell production in antigen-primed mice splenocyte”, J. Microbiol. Biotechnol, 14. 167-170.

30. Leroy F., De Vuyst L. (2004), “Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry”, Trends Food Sci Technol, 15. 67-78.

31. Li H., Qiu T., Chen Y. (2011), “Separation of gamma-aminobutyric acid from fermented broth”, J Ind Microbiol Biotechnol, 38. 1955-1959.