Xây dựng đường chuẩn GABA
+ Pha loãng GABA chuẩn ở các nồng độ 0, 1, 2, 4, 8, 16 mM. + Bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nƣớc trong 10 phút. + Làm khô bằng thiết bị cô quay.
+ Thêm 1 ml LaCl3 nồng độ 70 mM. + Mẫu đƣợc lắc trong 15 phút.
+ Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Lấy 800 µl dịch lỏng sau khi ly tâm chuyển sang ống eppendorf mới. + Thêm 160 μl KOH 1 M vào dịch mới thu đƣợc, lắc đều trong 5 phút. + Tiếp tục ly tâm trong 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Lấy 550 μl dịch ly tâm + 200 μl đệm đệm K+pyrophosphat 0,5 M (pH 8,6) + 150 µl NADP 4 mM + 50 µl GABASE/ml + 50 µl α-ketoglutarate 20 mM. + Hỗn hợp dung dịch này đƣợc đọc trên máy đo quang phổ.
+ Bƣớc sóng ban đầu đọc ở 340 nm trƣớc khi bổ sung α-ketoglutarate.
+ Sau khi bổ sung α-ketoglutarate trong 60 phút. Đo lần hai với bƣớc sóng 340 nm.
Xác định nồng độ GABA trong dịch mẫu
+ Dịch lên men sau khi đã đƣợc ly tâm, bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nƣớc trong 10 phút.
+ Bổ sung 400 ml methanol, ủ ở 25ºC trong bể nƣớc trong 10 phút. + Sau đó đƣợc làm khô bằng thiết bị cô quay.
+ Thêm 1ml LaCl3 nồng độ 70 mM. + Mẫu đƣợc lắc trong 15 phút.
22
+ Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. + Lấy 800 μl dịch lỏng sau khi ly tâm sang ống eppendorf mới.
+ Thêm 160 μl KOH 1 M vào dịch mới thu đƣợc, lắc đều trong 5 phút. + Tiếp tục ly tâm trong 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Lấy 550 μl dịch ly tâm + 200 μl đệm đệm K+pyrophosphat 0,5 M (pH 8,6) + 150 µl NADP 4 mM + 50 µl GABASE/ml + 50 µl α-ketoglutarate 20 mM. + Hỗn hợp dung dịch này đƣợc đọc trên máy đo quang phổ.
+ Bƣớc sóng ban đầu đọc ở 340 nm trƣớc khi bổ sung α-ketoglutarate.
+ Sau khi bổ sung α-ketoglutarate trong 60 phút. Đo lần hai với bƣớc sóng 340 nm. + Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng GABA chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của GABA.