3.1.8.1. pH thích hợp cho lên men
Vi khuẩn phát triển đƣợc phụ thuộc khá nhiều vào thông số pH. Đặc biệt là các chủng Lactobacillus thƣờng có dải pH nằm ở vùng axít và axít yếu. Để tìm ra đƣợc pH tối ƣu cho quá trình lên men của chủng KC1 trong môi trƣờng dịch cám gạo, môi trƣờng dịch cám gạo đã đƣợc điều chỉnh với dải pH nhƣ đã chỉ ra ở phần phƣơng pháp. Sau đó, các môi trƣờng pH khác nhau đƣợc lên men tại nhiệt độ 30°C trong 96 giờ, tốc độ lắc là 150 vòng/phút. Dịch sau khi lên men đƣợc đem ly tâm và đánh giá hàm lƣợng GABA theo phần phƣơng pháp. Kết quả trên hình 13 cho thấy hàm lƣợng GABA thay đổi khá nhiều khi thay đổi các thông số pH, với pH ở vùng axít mạnh hàm lƣợng GABA sinh ra thấp hơn so với pH ở vùng kiềm. Đặc biệt, với pH nằm ở
Tỉ lệ MSG(%) GABA (mM)
Môi trƣờng MRS Môi trƣờng cám gạo
3 172 169 5 280 283 7 369 379 10 592 576 12 674 682 15 663 672
41
vùng hơi axít cho lƣợng GABA nhiều nhất, với pH 6,5 cho hàm lƣợng GABA cao nhất là 239 mM. 5 .0 5 .5 6 .0 6 .5 7 .0 7 .5 8 .0 8 .5 9 .0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 pH G A B A ( m M ) Hình 13: Ảnh hƣởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá
trình lên men dịch chiết cám gạo
3.1.8.2. Nhiệt độ thích hợp cho lên men.
Đối với các vi sinh vật việc thay đổi nhiệt độ sẽ ảnh hƣởng mạnh tới khả năng phát triển và có thể ảnh hƣởng trực tiếp lên những sản phẩm thứ cấp sinh ra từ các vi sinh vật này. Do vậy, việc xác định nhiệt độ tối ƣu cho quá trình lên men môi trƣờng dịch cám gạo bằng Lactobacillus plantarum KLEPT để sinh GABA có vai trò rất quan trọng đến hiệu quả sản xuất. Quá trình lên men đƣợc đặt tại các dải nhiệt độ khác nhau theo phần phƣơng pháp. Dịch sau khi lên men đƣợc ly tâm và đánh giá hàm lƣợng GABA theo phần phƣơng pháp. Kết quả đƣợc chỉ ra ở hình 14, nhiệt độ ảnh hƣởng rất mạnh tới quá trình sinh ra GABA. Khi nhiệt độ thấp hoặc cao thì khả năng sinh GABA sẽ giảm mạnh. Bởi vì tại nhiệt độ này thƣờng không thích hợp đối với điều kiện sinh trƣởng của các vi khuẩn lactic hay Lactobacillus plantarum
KLEPT. Ở hình 14 cho thấy rõ ở nhiệt độ 34°C thì lƣợng GABA đƣợc sinh ra cao nhất với nồng độ là 252 mM.
42 0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 t ° ( ° C ) G A B A ( m M )
Hình 14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo.
3.1.8.3. Thời gian thích hợp cho lên men
Thời gian lên men sẽ ảnh hƣởng mạnh tới hiệu suất của quá trình lên men. Khi thời gian lên men ít thì hàm lƣợng GABA sẽ chƣa sinh ra hoặc vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu suất tối đa. Nhƣng thời gian lên men kéo dài quá cũng ảnh hƣởng tới chất lƣợng của sản phẩm cần quan tâm và hiệu quả kinh tế bị ảnh hƣởng mạnh. Chính vì vậy, dịch cám gạo sau khi đã xử lý nhƣ phần phƣơng pháp đƣợc tiến hành thu mẫu ở các thời điểm khác nhau nhƣ phần phƣơng pháp, sau đó đem đánh giá hàm lƣợng GABA. Kết quả thu đƣợc ở hình 15, sau 24 giờ đã xuất hiện GABA có trong dịch lên men. Tuy nhiên, hàm lƣợng này tăng dần theo các điểm thời gian và dừng lại sau 96 giờ. Còn ở 120 giờ thì hàm lƣợng GABA đã có xu hƣớng giảm nhẹ. Từ kết quả này chỉ ra lƣợng GABA sinh ra cao nhất là 193 mM khi lên men kéo dài sau 96 giờ.
43 0 2 4 4 8 7 2 9 6 1 2 0 1 4 4 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 t im e ( h ) G A B A ( m M )
Hình 15:Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo.
3.1.8.4. Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men
Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) là vi khuẩn lactic phát triển đƣợc cần không khí. Do vậy, để cho KC1 phát triển mạnh nhất và làm tăng hoạt tính mạnh nhất thì việc khảo sát tỉ lệ ôxy cung cấp vào môi trƣờng lên men là rất cần thiết. Quá trình lên men bằng dịch cám gạo đã đƣợc theo dõi ở các tỉ lệ ôxy khác nhau nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả chỉ ra ở hình 16. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng GABA phụ thuộc khá mạnh vào tỉ lệ ôxy cung cấp thêm vào dịch lên men. Khi tỉ lệ ôxy thấp thì lƣợng GABA sinh ra thấp và ngƣợc lại. Tuy nhiên, khi tỉ lệ ôxy quá cao thì hàm lƣợng GABA lại có xu hƣớng giảm đi. Điều này có thể do vi khuẩn bị ức chế quá trình sinh trƣởng và hoạt tính GAD bị ức chế. Với tỉ lệ 40% ôxy cho hàm lƣợng GABA cao nhất là 198 mM trong quá trình lên men dịch cám gạo bằng KC1.
44 0 2 0 4 0 6 0 8 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 O2( % ) G A B A ( m M )
Hình 16: Ảnh hƣởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo
45
3.1.9. Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo
Từ các điều kiện tối ƣu đã tìm đƣợc ở trên cho phép đƣa ra sơ đồ quy trình lên men dịch cám gạo tối ƣu trên hình 17.
Cám gạo đã loại dầu + H2O (tỉ lệ 1:5)
Hoạt hóa KC1 từ ống thạch nghiêng Thu dịch đánh giá lƣợng GABA tạo thành Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo
Ly tâm 5000 vòng/phút, 15 phút Nhân chủng cấp 1
Xử lý nhiệt 130ºC, trong thiết bị khử trùng
Làm lạnh, ly tâm
Dịch thu đƣợc bổ sung H2O
Bổ sung thêm 1% NaCl, 1% cao nấm men, 1% glucose, 12% mỳ chính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lên men (pH 6,5; 34ºC, 40% O2, 96 giờ, 1% chủng
46
3.2. Đánh giá hoạt tính của GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Sau khi tiến hành lên men theo quy trình trên, dịch lên men đƣợc đông khô và tinh chế để thu GABA nguyên chất thu đƣợc kết quả trên hình 18. Sử dụng GABA tinh chế và GABA chuẩn tiến hành kiểm tra bằng chạy sắc ký bản mỏng thu đƣợc kết quả trong hình 19, dịch lên men sau khi tinh chế cho hàm lƣợng GABA không còn tạp chất và hàm lƣợng tƣơng đƣơng GABA chuẩn. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể kết luận đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp cho lên men sản xuất GABA trên môi trƣờng cám gạo thành công.
A B
Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B)
1 2 3
Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC
1: GABA chuẩn, 2:GABA và MSG, 3: GABA dịch lên men sau khi tinh chế GABA
47
3.3. Đánh giá hoạt tính của GABA
3.3.1. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12
Để khẳng định GABA sinh ra đƣợc từ chủng Lactobacillus plantarum
KLEPT có hoạt tính sinh học, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính của GABA sinh ra thông qua việc đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12 (dòng tế bào đƣợc phân lập từ hệ thần kinh chuột). Sau khi tế bào PC12 đã đƣợc hoạt hóa ở tủ nuôi cấy tế bào trong 24 giờ, các tế bào này đƣợc chia vào đĩa 96 giếng và đƣợc nuôi tiếp trong tủ nuôi tế bào. Sau 24 giờ, các tế bào này sẽ đƣợc bổ sung dịch lên men có GABA. Sau 60 phút, bổ sung thêm H2O2 với nồng độ nhƣ đã chỉ ra ở phần phƣơng pháp [2.2.3.1]. Sau 24 giờ, sử dụng kit để đánh giá khả năng sống chết của tế bào sau khi đƣợc tiền xử lý và không tiền xử lý cùng với GABA. Hình 20 là kết quả sau khi đánh giá mật độ sống chết của tế bào. Từ kết quả này cho thấy ở nồng độ 20 µl/ml dịch lên men có chứa GABA thì khả năng tế bào sống đã đƣợc cải thiện hơn rất nhiều so với tế bào không đƣợc tiền xử lý cùng với dịch lên men có chứa GABA gần 90%. Với nồng độ 50 µl/ml dịch lên men có chứa GABA thì khả năng sống của tế bào đã đƣợc cải thiện gần nhƣ 100% so với tế bào không đƣợc tiền xử lý trƣớc khi ủ với H2O2. Việc đánh giá hoạt tính của GABA là rất quan trọng quyết định đến cả quá trình lên men. Bởi vì, nếu GABA sinh ra không có hoạt tính thì việc sản xuất GABA sẽ không có ý nghĩa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra đƣợc GABA sinh ra bằng chủng Lactobacillus plantarum KLEPT có hoạt tính tốt và hoàn toàn có khả năng tiếp tục nghiên cứu để tìm kiếm môi trƣờng thay thế MRS vì giá thành cao sẽ không có lợi cho việc sản xuất GABA với số lƣợng lớn.
48
Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng
Lactobacillus plantarum KLEPT. 3.3.2. Xác định GABA bằng HPLC
Thành phần GABA trong dịch lên men đã đƣợc chúng tôi xác định bằng phƣơng pháp so màu. Tuy nhiên, để khẳng định thêm độ chính xác của GABA tạo thành chúng tôi đã tiến hành phân tích GABA trong dịch lên men bằng phƣơng pháp HPLC. Bản thân GABA không hấp thụ ánh sáng nhìn thấy, UV hay huỳnh quang. Chính vì vậy, để phân tích đƣợc GABA bằng HPLC cần phải chuyển GABA sang một dẫn xuất có khả năng hấp thụ tốt UV hoặc vùng ánh sáng thƣờng hoặc là huỳnh quang mạnh để bắt đƣợc sản phẩm. Trƣớc tiên, GABA chuẩn đƣợc phân tích giống nhƣ phần phƣơng pháp bằng thiết bị HPLC. Sau khi chạy sắc ký cho kết quả ở hình 21. Từ sắc ký đồ thu đƣợc cho thấy GABA chuẩn sau khi đƣợc thôi bằng đệm sẽ cho một pick duy nhất sau 19 phút.
Tỉ lệ tế bào sống sót 0 50 75 100 DM - 20 50 - 20 50 - 20 50 (µg/ml ) 50 100 200 (µM)
49
Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn
Tiến hành chạy sắc ký GABA chuẩn ở các nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50µl chúng tôi xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn GABA trên hình 22, đƣờng chuẩn này là cơ sở xác định đƣợc nồng độ GABA trong mẫu dịch nghiên cứu.
Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC
Tiếp tục chạy sắc ký dịch lên men thô nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tôi thu đƣợc sắc ký đồ có nhiều pic khác nhau (hình 23). Tuy nhiên, sắc ký đồ vẫn cho pick giống với pick của GABA chuẩn sau 19 phút thôi cột. Điều đó cho phép chúng tôi khẳng định một lần nữa trong dịch lên men đã sinh ra GABA.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 100 200 300 400 500 mAU 358nm,4nm (1.00) 0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5
50
Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men
Sau khi chạy sắc ký mẫu dịch lên men thô, chúng tôi tiến hành chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột để kiểm tra độ tinh sạch của GABA trong mẫu dịch lên men, kết quả trên hình 24C chỉ còn một pick duy nhất xuất hiện ở phút 19, đó chính là pick của GABA trong mẫu lên men.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 25 50 75 100 125 150mAU358nm,4nm (1.00)
51 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A
B
C
Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột
Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu dịch lên men chúng tôi chạy sắc ký mẫu lên men sau khi tinh sạch với nồng độ 20 µl và đƣa vào đƣờng chuẩn GABA, kết quả trên hình 25 cho thấy GABA trong mẫu dịch lên men sau khi tinh sạch đạt độ tinh sạch khá cao 96,7%. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 100 200 300 mAU 358nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 50 100 150 mAU 358nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min 0 100 200 300 400 500 mAU 358nm,4nm (1.00)
52
Level Conc Mean Area S % RSD Area 1 Area 2
1 10 2516827 2516827 0
2 20 6154657 124699.2 2.026095 6242833 6066482
3 30 9151430 9151430 0
4 40 12149212 12149212 0
5 50 16341778 16341778 0
Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh sạch vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh sạch của mẫu
Kết quả mẫu tinh sạch đạt độ tinh sạch cao 96,7 %
3.3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của GABA thông qua thụ thể 3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1 3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1
Việc nuôi tế bào WSS-1 phát triển là một vấn đề quyết định đến quá trình thử hoạt tính của GABA. Chính vì vậy, tế bào đã đƣợc tiến hành nuôi cấy trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt và theo phần phƣơng pháp. Sau khi tế bào đƣợc nuôi trong tủ nuôi cấy tế bào với tỉ lệ CO2 là 5%, nhiệt độ 37°C và đƣợc quan sát trên kính hiển vi. Kết quả trên hình 26A cho thấy tế bào dính kết và tăng sinh nhiều sau 24 giờ. Tỉ lệ tế bào này tiếp tục tăng sinh lên sau 48 giờ (hình 26B).
0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5
53 .
A B
Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy (A), sau 48 giờ nuôi cấy (B)
3.3.3.2. Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào WSS-1 WSS-1
Việc đánh giá hoạt tính của GABA sau khi sản xuất sẽ quyết định chất lƣợng toàn bộ công nghệ sản xuất lên men từ dịch cám gạo bởi vì nếu sản phẩm tạo ra không có hoạt tính thì sản phẩm sẽ không có ý nghĩa về dƣợc tính và sẽ không có tác động đến điều trị bệnh. Chính vì vậy, việc đánh giá hoạt tính dựa ngay vào tác động của thụ thể GABA trên dòng tế bào WSS-1 có một ý nghĩa vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã áp dụng dòng tế bào này trong việc xác định hoạt tính sinh học của dịch GABA sau khi lên men. Tế bào đƣợc phân chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng và thao tác theo phần phƣơng pháp. Tế bào trong các giếng của đĩa 96 đƣợc đem đo khả năng hấp thụ quang học ở bƣớc sóng 405 nm. Kết quả đọc đƣợc ghi lại và sử dụng phần Xcell cho kết quả ở hình 27. Từ kết quả này cho thấy, tế bào không đƣợc xử lý bằng GABA thì khả năng hấp thụ Iot là gần nhƣ bằng 0. Tuy nhiên, khi tế bào đƣợc xử lý bằng GABA chuẩn và các nồng độ GABA lên men ở dạng thô thì khả năng thay đổi màu của Iot là rất rõ ràng.
54
Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên men
3.3.3.3. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot
Phƣơng pháp định lƣợng GABA bằng so màu thông thƣờng cho kết quả chính xác và đã đƣợc áp dụng từ nhiều năm. Tuy nhiên, việc định lƣợng này không tác động lên đích thực sự của hoạt động tế bào. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp định lƣợng GABA trong dịch lên men bằng phƣơng pháp so màu với Iôt để từ mật độ quang thu đƣợc sẽ suy ra nồng độ GABA và đánh giá luôn đƣợc hoạt tính. Điều này có vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển thực phẩm chức năng để xác định sản phẩm có tác động thực sự lên đích của tế bào hay không. Để đánh giá đƣợc chính xác hàm lƣợng GABA đƣợc tạo thành trong dịch lên men cần phải xây dựng một đƣờng chuẩn của GABA. Dựa vào đƣờng chuẩn này sẽ đo đƣợc hàm lƣợng GABA trong dịch lên men bằng cách suy ra từ mật độ quang thu đƣợc.
Xây dựng đường chuẩn
Một dải nồng độ GABA đã đƣợc pha nhƣ phần phƣơng pháp. Sau đó, các nồng độ này đƣợc đƣa vào đĩa có chứa tế bào WSS-1. Sau đó, các tế bào này đƣợc đem đánh giá khả năng hấp thụ màu ở bƣớc sóng 405 trên máy ELISA 6860. Kết
55
quả này đã cho đƣờng chuẩn GABA (hình 28). Dựa vào đƣờng chuẩn này, chúng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});