pH thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ đƣợc bổ sung 5% MSG ở các giá trị pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Sau đó cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT để ở nhiệt độ 30ºC, 96 giờ cùng với tỉ lệ oxy 40% để đánh giá hiệu quả pH trong quá trình sản xuất GABA.
Nhiệt độ thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo sẽ đƣợc bổ sung 5% MSG, pH=6. Sau đó cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT ở các nhiệt độ 18ºC, 22ºC, 26ºC, 30ºC, 34ºC, 38ºC, 42ºC, lên men trong 96 giờ cùng với tỉ lệ ôxy 40% để đánh gía ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên bằng dịch cám gạo.
24
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6. Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, và tỉ lệ ôxy 40% .
Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men
1 lít dịch từ 10 lít chiết trong 1 kg cám gạo bổ sung thêm 5% MSG, pH=6. Sau đó, cấy 1% Lactobacillus plantarum KLEPT giữ ở 30ºC trong 96 h, và tỉ lệ ôxy 0%, 10%, 20%, 40%, 60%.
2.2.2. Tinh chế GABA [31] 2.2.2.1. Khử màu
+ Lấy dịch lên men sau khi đã đƣợc ly tâm bổ sung thêm than hoạt tính. + Khuấy đều sau đó giữ ở 80°C trong 20 phút.
+ Tiếp tục khuấy trong 10 phút. + Lọc thu dịch.
+ Dịch này cho vào đông khô và hòa lại với nƣớc cất.
2.2.2.2. Khử muối
+ Dịch này sẽ đƣợc bổ sung thêm cồn tuyệt đối. + Giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 h.
+ Lọc thu dịch và loại bỏ lƣợng cồn bằng thiết bị cô chân không. + Dịch còn lại đƣợc bổ sung thêm nƣớc cất.
2.2.2.3. Chạy sắc ký trao đổi ion
Chuẩn bị cột
+ Chuẩn bị nhựa sulfonate-polystyrene có bản chất là nhựa trao đổi cation mạnh của hãng Sigma (IR-120 Plus) ngâm trong nƣớc cất trong 12 h.
+ Sau đó đƣa nhựa trao đổi ion này lên cột.
+ Tiếp tục cân bằng cột bằng HCl 1 N với tốc độ dòng chảy là 0,9 l/h. + Rửa lại cột bằng nƣớc cất.
25
Đƣa mẫu lên cột
+ Mẫu đƣợc đƣa với tốc độ 0,6 l/h.
+ Tiếp tục rửa trôi bằng nƣớc cất với tốc độ là 1,2 l/h.
+ Tiếp tục rửa trôi bằng đệm NH3 nồng độ là 0,1 M với tốc độ 1,2 l/h.
Thôi cột
+ Thôi cột bằng NH3 nồng độ 1 M với tốc độ là 0,6 l/h. + Dịch thôi ra đƣợc thu với các phân đoạn có thể tích là 5 ml. + Phân tích định tính GABA ở mỗi phân đoạn thu đƣợc. + Các phân đoạn có GABA tiếp tục đƣợc kết tinh.
2.2.2.4. Kết tinh GABA
+ Các phân đoạn thu đƣợc sẽ bổ sung thêm cồn tuyệt đối. + Sau đó để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút. + Tinh thể GABA sẽ kết tinh ở dƣới đáy.
+ Lọc thu tinh thể GABA.
+ Sau đó sấy tinh thể GABA ở 60°C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Thu lấy GABA và phân tích GABA bằng định tính.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính GABA
2.2.3.1. Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12
+ 1 ml tế bào ở trong ống đƣợc lấy ra từ Nitơ lỏng đƣợc hút ra cho vào ống fancol 15 ml có chứa 9 ml môi trƣờng RPMI 1640.
+ Ly tâm ở 1500 vòng/phút, trong 5 phút.
+ Hút dịch nổi bỏ đi và bổ sung 9 ml môi trƣờng RPMI 1640 có bổ sung 1 ml FBS, 1% penicilin và strepomycin.
+ Sau đó, dịch này đƣợc đổ ra đĩa peptri và ủ trong tủ nuôi cấy tế bào ở 37ºC, 5% CO2, sau 24 giờ.
26
+ Tế bào thu đƣợc sẽ đƣợc phân chia đều vào đĩa 96 giếng sao cho có nồng độ 1x105 tế bào/giếng.
+ Sau đó, đƣợc duy trì ở tủ nuôi cấy, sau 24 giờ.
2.2.3.2. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào
Khả năng sống của tế bào đƣợc đánh giá bằng sử dụng kitCellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay.
+ Tế bào PC12 đƣợc ủ cùng với dịch GABA thu đƣợc sau khi nuôi cấy bằng chủng
KC1.
+ Sau đó, tế bào đƣợc ủ tiếp với H2O2 (50 µM, 100 µM, 200 µM) trong 24 giờ. + Sau quá trình này, 10 µl của dung dịch kit đƣợc đƣa vào các giếng đã đƣợc ủ cùng với dịch lên men trong 1 giờ. Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ đƣợc đo ở bƣớc sóng 490 nm bằng máy đọc ELISA (Biorad 6860, Mỹ).
+ Giá trị hấp thụ ở 490 nm của mỗi mẫu này đƣợc tính nhƣ tỉ lệ phần trăm so với mẫu không đƣợc xử lý với GABA và H2O2 (xem nhƣ 100% tế bào sống).
2.2.3.3. Xác định GABA bằng phƣơng pháp HPLC [42]
+ Mẫu tinh sạch đƣợc hòa tan trong nƣớc theo nồng độ nhất định. Sau đó hòa tan lƣợng mẫu này ( V/V = 50/50) trong hỗn hợp chứa OPA 1.0 mL methanolic OPA, 25 µL 2-mercaptoethanol. Dung dịch sau đó đƣợc đƣa lên phân tích ngay.
+ Cột sử dụng phân tích là cột C18 (250 mm x 4,6 mm) đệm dùng phân tích gồm đệm A là 0.05 M sodium acetate (pH 7.2), đệm B gồm 0.1 M sodium acetate, acetonitrile và methanol tỉ lệ 46:44:10 (v/v), pH 7.2.
+ Chạy mẫu theo gradient và phân tích kết quả thu đƣợc.
2.2.3.4. Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49]
+ Tế bào WSS-1 đƣợc chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ.
+ Loại bỏ môi trƣờng và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nƣớc cất) cho mỗi giếng.
27
+ Thêm 10 μM GABA chuẩn, 10, 20, 30, 40 μM dịch lên men vào giếng. Ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Loại bỏ môi trƣờng, bổ sung đệm phá tế bào 100 µl (1% Triton X-100, pha trong nƣớc cất).
+ Đem đo ở bƣớc sóng 405 nm.
2.2.3.5. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot
Xây dựng đường chuẩn GABA
+ Tế bào WSS-1 đƣợc chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Loại bỏ môi trƣờng và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nƣớc cất) cho mỗi giếng.
+ Bổ sung lƣợng GABA vào mỗi giếng với các nồng độ nhƣ sau: 500 µM; 250 µM; 125 µM; 62,5 µM; 31,3 µM; 15,6 µM.
+ Dung dịch không cho GABA đƣợc coi là có nồng độ 0 µM. + Ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Loại bỏ môi trƣờng, bổ sung đệm phá tế bào 100 µl (1% Triton X-100, pha trong nƣớc cất).
+ Đem đo ở bƣớc sóng 405 nm.
+ Sau khi thu đƣợc các dung dịch đã xử lý nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn là đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa OD đo đƣợc và nồng độ thực tế của nồng độ GABA.
Xác định hàm lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot
+ Tế bào WSS-1 đƣợc chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và ủ trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ.
+ Loại bỏ môi trƣờng và thêm 100 μl đệm iot (NaI 5 µM, pha trong nƣớc cất) cho mỗi giếng.
28
+ Loại bỏ môi trƣờng, bổ sung đệm phá tế bào 100 µl (1% Triton X-100, pha trong nƣớc cất).
+ Đem đo ở bƣớc sóng 405 nm.
+ Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính GABA chuẩn sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của GABA.
29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo
3.1.1. Khả năng sinh GABA của chủng KC1
Để đánh giá đƣợc khả năng sinh GABA của chủng KC1, chúng tôi đã tìm phƣơng pháp thích hợp để khẳng định đƣợc khả năng sinh GABA của chủng này. Dịch tế bào sau khi lên men trên môi trƣờng MRS có bổ sung MSG theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.2] đƣợc đem ly tâm. Sau khi ly tâm, 0,5 µl dịch này đƣợc chấm lên bản sắc ký mỏng cùng với GABA chuẩn đƣợc hòa tan trong dung dịch NaOH. Kết quả trên hình 6 cho thấy trên đƣờng chạy của mẫu lên men có rất nhiều chất khác nhau. Tuy nhiên, kết quả này cũng chỉ ra một vệt rất rõ và đậm có kích thƣớc gần tƣơng đƣơng với vết trên đƣờng chạy GABA chuẩn. Nhƣ vậy, trong dịch lên men đã có sản phẩm GABA sinh ra.
1 2
Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trƣờng MRS . Đƣờng 1: Dịch lên men, Đƣờng 2: GABA chuẩn
3.1.2. Các chỉ tiêu chất lƣợng và an toàn thực phẩm của cám gạo
Trƣớc khi lựa chọn cám gạo để nghiên cứu cho quá trình lên men. Cả hai mẫu cám gạo của tỉnh Thái Bình, Đồng bằng sông Cửu Long đã đƣợc chúng tôi phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng và an toàn thực phẩm theo một số tiêu chuẩn của Cục An toàn thực phẩm phát hành. Cám gạo của hai tỉnh đã đƣợc đánh giá các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, tro tổng số, chất xơ tổng số, các mảnh sắc nhọn. Đây là một trong số những chỉ tiêu đƣợc Cục An toàn thực phẩm yêu cầu kiểm tra đối với nguồn nguyên liệu ban đầu trƣớc khi đem đi chế biến. Từ
30
bảng 2 cho thấy các chỉ tiêu chất lƣợng của mẫu cám gạo tỉnh Thái Bình và cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long đều đạt ngƣỡng cho phép của Cục An toàn thực phẩm.
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng của hai mẫu cám gạo
3.1.3. Đánh giá hoạt động của GAD trong cám gạo
GABA đƣợc tổng hợp từ khử cacbon của L-glutamate bằng GAD thƣờng phụ thuộc vào lƣợng PLP. Khi hoạt tính GAD hoạt động càng mạnh thì khối lƣợng GABA tạo ra càng nhiều. Việc đầu tiên chúng tôi phải xác định điều kiện môi trƣờng tối ƣu để GAD trong cám gạo hoạt động mạnh nhất đối với quá trình sản xuất GABA. Do vậy, chúng tôi đã bổ sung một dãy các nồng độ MSG vào dịch cám gạo giống nhƣ ở phần phƣơng pháp. Sau đó bổ sung thêm các nồng độ của PLP và một số mẫu dịch cám gạo không bổ sung PLP. Các mẫu dịch cám gạo sau khi đã đƣợc ủ ở các thời gian khác nhau nhƣ phần phƣơng pháp đƣợc đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, các dịch này đƣợc xác định hàm lƣợng GABA. Từ đây, chúng tôi đánh giá đƣợc hoạt tính của GAD. Từ kết quả của hình 7 cho thấy hoạt tính của GAD phụ
STT Tên chỉ tiêu chất lƣợng
Đơn vị tính
Mẫu cám gạo
Tiêu chuẩn cho phép Thái Bình Đồng bằng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sông Cửu Long
1 Độ ẩm g/100g 11,3 12 12 2 Protein g/100g 13,7 14,1 13 3 Lipid g/100g 14,7 12,6 12 4 Tro tổng số g/100g 7,2 6,5 15 5 Chất xơ tổng số g/100g 3,4 1,0 8 7 Mảnh vật sắc
31
thuộc vào nồng độ của MSG và đạt giá trị cao nhất khi MSG có nồng độ là 100 mM, và sẽ giảm dần khi lƣợng MSG cao hơn. Từ kết quả này cũng cho thấy hoạt tính của GAD phụ thuộc vào PLP. Khi không bổ sung PLP (đƣờng hình màu đỏ) thì hoạt độ của GAD thấp hơn nhiều so với mẫu có bổ sung PLP (đƣờng hình màu xanh). Điều này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu đã đƣợc công bố trƣớc đây [34].
Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo đƣợc xác định thông qua MSG. 3.1.4. Xác định thành phần và lựa chọn nguyên liệu cám gạo
3.1.4.1. Xác định định tính glutamic acid trong hai mẫu cám gạo
Glutamic acid là một thành phần quan trọng có thể chuyển hóa thành GABA, do đó sẽ quyết định việc lựa chọn cám gạo làm dịch lên men tạo thành GABA. Vì vậy chúng tôi đã xác định định tính glutamic acid trong cả hai mẫu cám. 100 g cám gạo đã loại bỏ dầu đƣợc tiến hành phân tích glutamic acid theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.4]. Dịch sau khi đƣợc chiết xuất bằng phƣơng pháp nƣớc siêu tới hạn đƣợc đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó dịch này đƣợc thu lại và tiến hành chạy sắc ký bản mỏng nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả thu đƣợc chỉ ra ở hình 8. Từ kết quả này, chúng tôi thấy cả hai mẫu cám gạo đều có glutamic cid. Tuy nhiên, về mặt định tính cho thấy lƣợng glutamic acid ở cám gạo Thái Bình là nhiều
250 200 150 1 50 100 6 5 4 3 2 7 Hoạt tính của GAD (μmol/min/g) MSG (mM) 0 Mẫu bổ sung PLP Mẫu không bổ sung PLP
32
hơn theo đƣờng chạy số 1, lƣợng glutamic acid ở trong cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long là rất ít theo đƣờng chạy số 3.
Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC Đƣờng 1: Mẫu cám gạo Thái Bình. Đƣờng 2: Glutamic acid chuẩn. Đƣờng 3: Mẫu cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long
3.1.4.2. Định lƣợng glutamic acid trong hai mẫu cám gạo
Đường chuẩn Glutanic acid
Để tìm ra đƣợc các thông số lên men tối ƣu và đánh giá đƣợc hiệu quả của quá trình lên men thì việc định lƣợng đƣợc hàm lƣợng glutamic acid là rất quan trọng. Việc định lƣợng glutamic acid sẽ thông qua việc xây dựng đƣờng chuẩn dựa vào sự thay đổi khả năng hấp thụ quang học của các nồng độ glutamic acid khác nhau. Lƣợng glutamic acid đƣợc pha ở các nồng độ theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.6]. Sau đó, các mẫu này đƣợc đo mật độ quang thực hiện theo nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả trên hình 9 cho thấy ứng với mỗi một nồng độ khác nhau của glutamic acid sẽ đo đƣợc một mật độ quang tƣơng ứng. Trên dữ liệu này, ứng dụng phần mềm Xcell đã xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn glutamic acid với hai thông số nồng độ (mM) và mật độ hấp thụ quang học tƣơng ứng (OD) (hình 9). Dựa trên đƣờng chuẩn xây dựng này sẽ định lƣợng đƣợc lƣợng glutamic acid tạo thành.
33 Y là giá trị OD
X là nồng độ Glutamicacid (mM)
Hình 9: Đƣờng chuẩn glutamic acid
Hàm lượng Glutamic acid trong hai loại cám gạo
Sau khi hai mẫu cám gạo đã xác định đƣợc đều có glutamic acid, chúng tôi tiếp tục tiến hành định lƣợng glutamic acid trong mỗi mẫu cám gạo. Dịch chiết cám gạo của hai tỉnh Thái Bình và Đồng bằng sông Cửu Long đã đƣợc xử lý theo phần phƣơng pháp. Hai mẫu dịch đƣợc xác định hàm lƣợng glutamic acid theo phần phƣơng pháp [2.2.1.6]. Bằng phƣơng pháp so màu đã cho kết quả ở bảng 4. Lƣợng glutamic acid của tỉnh Thái Bình là 0,25 mg/g. Trong khi đó lƣợng glutamic acid trong cám gạo Đồng bằng sông Cửu Long là 0,03 mg/g. Kết quả này cũng gần giống với phần định tính đã chỉ ra.
Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo
Từ kết quả phân tích định tính và định lƣợng trên, chúng tôi đã quyết định chọn cám gạo tỉnh Thái Bình làm nguyên liệu cho quá trình lên men sản xuất GABA từ cám gạo. y = 0.003x + 0.049 R² = 0.995 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 5 10 15 20
Tỉnh Thái Bình Đồng Bằng Sông Cửu Long Glutamic acid (mg/g trọng lƣợng khô) 0,25 0,03
glutamic acid (mM) OD570
34
3.1.5. Lƣợng glutamic acid thu đƣợc bằng phƣơng pháp nƣớc sôi
Phƣơng pháp này dựa vào quá trình gia nhiệt và thời gian để đánh giá hàm lƣợng glutamic acid sinh ra. Một dải nhiệt độ bắt đầu từ 80°C cho đến 140°C đã đƣợc tiến hành tại nhiều thời gian khác nhau bằng gia nhiệt trong nồi khử trùng. Dịch sau khi đã gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau tƣơng ứng với các khoảng thời gian từ 5, 10, 20, 30 phút đƣợc lấy để đánh giá hàm lƣợng glutamic acid theo phần phƣơng pháp. Kết quả đã chỉ ra ở hình 10, cả 7 điểm nhiệt độ tại thời điểm sau 5 phút đều đã chiết xuất ra glutamic acid. Tuy nhiên, điểm 140°C lại cho hàm lƣợng glutamic acid thấp nhất. Có thể vì khi ở nhiệt độ cao nên khả năng biến tính