màu.
Để tìm ra đƣợc các thông số lên men tối ƣu và đánh giá đƣợc hiệu quả của quá trình lên men thì việc định lƣợng đƣợc hàm lƣợng GABA là rất quan trọng. Việc định lƣợng GABA sẽ thông qua việc xây dựng đƣờng chuẩn dựa vào sự thay đổi khả năng hấp thụ quang học của các nồng độ GABA khác nhau. Lƣợng GABA đƣợc pha ở các nồng độ theo nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.1.9]. Sau đó, các mẫu này đƣợc đo mật độ quang thực hiện theo nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả trên hình 11 cho thấy ứng với mỗi một nồng độ khác nhau của GABA sẽ đo đƣợc một mật độ quang tƣơng ứng. Trên dữ liệu này, ứng dụng phần mềm Xcell đã xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn GABA với hai thông số nồng độ (mM) và mật độ hấp thụ quang học tƣơng ứng (OD) (hình 11). Dựa trên đƣờng chuẩn xây dựng này sẽ định lƣợng đƣợc lƣợng GABA tạo thành trong quá trình lên men.
80ºC 90ºC 100ºC 110ºC 120ºC 130ºC 140ºC phút 0,05 0,15 0,2 0,25 0,1 35 30 25 20 15 10 5 0 glutamic acid (mg/g) 0,3
36
Trong đó: Y là giá trị OD ; X là nồng độ GABA (mM) Hình 11 : Đƣờng chuẩn GABA 3.1.7. Nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men
Hiệu quả của nguồn NaCl
Vi sinh vật thƣờng sẽ cần cung cấp thêm một số nguyên tố vô cơ trong quá trình phát triển. Do vậy, việc tìm kiếm và bổ sung thêm các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng. Để cung cấp thêm nguồn vô cơ trong môi trƣờng dịch cám gạo thì lƣợng NaCl đã đƣợc điều tra. Đây là một yếu tố vô cơ thƣờng đƣợc đòi hỏi trong quá trình phát triển của tế bào vi sinh vật. Dịch cám gạo đƣợc bổ sung NaCl ở các nồng độ nhƣ phần phƣơng pháp [2.2.10.1]. Sau đó, chúng tôi tiến hành lên men các dịch này với chủng KC1 ở nhiệt độ 34°C trong 96 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Dịch sau khi lên men đƣợc ly tâm tƣơng ứng với từng môi trƣờng lên men đã đƣợc bổ sung tỉ lệ NaCl khác nhau. Các dịch lên men này đƣợc đánh giá hàm lƣợng GABA và mật độ tế bào. Kết quả đã đƣợc chỉ ra ở hình 12. Nhƣ vậy, khi nồng độ NaCl cao sẽ gây ảnh hƣởng tới sự sống của tế bào. Tỉ lệ NaCl lớn hơn 1% lƣợng tế bào sẽ giảm mạnh và thậm chí tế bào không phát triển đƣợc với nồng độ NaCl 7%. Lƣợng tế bào giảm thì lƣợng GABA sinh ra cũng giảm theo với tỉ lệ NaCl tăng lên. Tuy nhiên, khi bổ sung với lƣợng NaCl 1% thì mật độ tế bào tăng lên khá mạnh so với không bổ sung. Từ các số liệu này chỉ ra với tỉ lệ 1% NaCl sẽ tạo điều kiện để chủng KC1 phát triển mạnh nhất và tƣơng ứng với sự phát triển này là hàm lƣợng GABA sinh ra cũng mạnh. R 2 = 1 0 0 4 GABA (mM) 0.06 OD340 0.02 0.01 0.05 0.04 0.03 2 8 16 y = 0.003x + 0.0069
37
Hình 12: Hiệu quả của NaCl với quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA
Hiệu quả của nguồn Cacbon
Để lên men của chủng KC1 trong môi trƣờng cám gạo cần thiết phải bổ sung thêm lƣợng cacbon để đảm bảo cho vi khuẩn phát triển mạnh từ đó sẽ có khả năng chuyển hóa GABA hiệu suất cao. Nguồn cacbon để vi khuẩn lactic phát triển có rất nhiều loại khác nhau tùy thuộc vào từng chủng. Do vậy, việc chọn nguồn nguyên liệu bổ sung cacbon ban đầu cho chủng KC1 là rất quan trọng. Một loạt các nguyên liệu có thể cung cấp bổ sung cacbon cho chủng KC1 đã đƣợc khảo sát. Cám gạo sau khi đã đƣợc xử lý phần chất béo đã đƣợc tiến hành tách chiết nhƣ phần phƣơng pháp. Môi trƣờng dịch cám gạo sau khi đƣợc ly tâm đã đƣợc bổ sung thêm riêng biệt Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manose theo các nồng độ nhƣ phần phƣơng pháp. Sau đó, các môi trƣờng này đƣợc lên men với chủng KC1 ở 34°C, trong 96 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Dịch sau khi lên men đƣợc ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, dịch đƣợc thu lại và đem xác định hàm lƣợng GABA theo phƣơng pháp. Kết quả ở bảng 5 cho thấy khi không đƣợc cung cấp thêm nguồn C thì mật độ tế bào phát triển thấp nhất và lƣợng GABA tƣơng ứng sinh ra cũng thấp nhất. Cả 5 nguồn cacbon đều cho mật độ phát triển tế bào mạnh và tƣơng ứng sinh ra một lƣợng lớn GABA. Tuy nhiên, khi bổ sung Glucose cho mật độ tế bào phát triển mạnh nhất ở 2% nhƣng lƣợng GABA sinh ra lại nhiều nhất khi Glucose bổ sung 1%.
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 NaCl 0 200 150 50 100 GABA (mM) OD600 GABA Sự phát triển tế bào
38
Bảng 5: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon Nguồn C Nồng độ (%) A600 Lƣợng GABA sinh ra (mM) - 0 4,2 140 Glucose 1 5,36 230 2 6,50 224 Fructose 1 5,12 202 2 5,28 196 Galactose 1 5,40 226 2 5,66 214 Lactose 1 4,24 148 2 4,22 146 Maltose 1 5,6 212 2 6,06 221
Hiệu quả của nguồn Nitơ
Đối với các vi sinh vật nói chung nguồn nitơ luôn luôn là cần thiết. Đặc biệt là đối với vi khuẩn lactic thì nguồn nitơ cung cấp chủ yếu thƣờng là nấm nem. Để tìm ra đƣợc lƣợng nitơ cung cấp tối ƣu trong môi trƣờng cám gạo thì một dải các nồng độ cao nấm men khác nhau đã đƣợc bổ sung vào môi trƣờng dịch cám gạo trƣớc khi lên men. Mỗi dịch lên men có bổ sung lƣợng nitơ khác nhau sẽ đƣợc lên men với chủng KC1 ở 34°C trong 96 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Sau đó, dịch lên men đƣợc ly tâm và đem xác định hàm lƣợng GABA tạo thành. Kết quả trên bảng 6 chỉ ra sự phát triển tế bào phụ thuộc vào nồng độ cao nấm men. Khi nồng độ cao nấm men càng cao thì mật độ tế bào phát triển càng mạnh. Tuy nhiên hàm lƣợng GABA sinh ra lại không theo quy luật này. Tại nồng độ cao nấm men 1% đã sinh ra GABA cao nhất là 232 mM. Mặc dù, với
39
16% cao nấm men, mật độ tế bào đạt cao nhất nhƣng lƣợng GABA sinh ra chỉ là 216 mM.
Bảng 6: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ
Nguồn Nitơ Nồng độ (%) OD600 Lƣợng GABA
sinh ra (mM) - 0 4,2 140 Cao nấm men 1 4,8 232 2 5,14 221 4 5,6 226 8 6,64 222 16 7,51 216
Hiệu quả của nguồn Monosodium glutamate (MSG)
Mì chính (MC) thay thế cho MSG là một nguồn cơ chất chính để enzym GAD chuyển hóa thành GABA. Chính vì vậy, việc xác định đƣợc tỉ lệ MC đƣa vào dịch cám gạo cho quá trình lên men quyết định đến hiệu suất quá trình lên men. Do vậy, chúng tôi đã đã đƣa tỉ lệ MC khác nhau vào hai loại môi trƣờng nhƣ phần phƣơng pháp. Dịch sau khi lên men đƣợc thu lại đem ly tâm. Sau đó, tiến hành đánh giá hàm lƣợng GABA. Kết quả chỉ ra trên bảng 7, khi tỉ lệ MC tăng thì hàm lƣợng GABA tƣơng ứng sẽ tăng lên. Điều này là hoàn toàn hợp lý vì khi lƣợng MC càng nhiều thì lƣợng MSG chuyển hóa càng mạnh. Tuy nhiên, khi MC là 15% thì lƣợng GABA có xu hƣớng giảm đi. Bởi vì lúc này lƣợng GAD trong vi khuẩn đã hết. Nhƣ vậy, với tỉ lệ MC là 12% cho khả năng sinh GABA cao nhất. Ngoài ra kết quả cho thấy hàm lƣợng GABA sinh ra ở cả hai môi trƣờng lên men với tỉ lệ MSG thay đổi là không có sự khác biệt. Từ đó chỉ ra sự thay thế môi trƣờng lên men bằng dịch
40
cám gạo có thể thực hiện đƣợc cho hiệu suất lên men tƣơng đƣơng với môi trƣờng MRS.
Bảng 7: Tỉ lệ MSG ảnh hƣởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi trƣờng
3.1.8. Các điều kiện lên men thích hợp trên môi trƣờng dịch cám gạo 3.1.8.1. pH thích hợp cho lên men 3.1.8.1. pH thích hợp cho lên men
Vi khuẩn phát triển đƣợc phụ thuộc khá nhiều vào thông số pH. Đặc biệt là các chủng Lactobacillus thƣờng có dải pH nằm ở vùng axít và axít yếu. Để tìm ra đƣợc pH tối ƣu cho quá trình lên men của chủng KC1 trong môi trƣờng dịch cám gạo, môi trƣờng dịch cám gạo đã đƣợc điều chỉnh với dải pH nhƣ đã chỉ ra ở phần phƣơng pháp. Sau đó, các môi trƣờng pH khác nhau đƣợc lên men tại nhiệt độ 30°C trong 96 giờ, tốc độ lắc là 150 vòng/phút. Dịch sau khi lên men đƣợc đem ly tâm và đánh giá hàm lƣợng GABA theo phần phƣơng pháp. Kết quả trên hình 13 cho thấy hàm lƣợng GABA thay đổi khá nhiều khi thay đổi các thông số pH, với pH ở vùng axít mạnh hàm lƣợng GABA sinh ra thấp hơn so với pH ở vùng kiềm. Đặc biệt, với pH nằm ở
Tỉ lệ MSG(%) GABA (mM)
Môi trƣờng MRS Môi trƣờng cám gạo
3 172 169 5 280 283 7 369 379 10 592 576 12 674 682 15 663 672
41
vùng hơi axít cho lƣợng GABA nhiều nhất, với pH 6,5 cho hàm lƣợng GABA cao nhất là 239 mM. 5 .0 5 .5 6 .0 6 .5 7 .0 7 .5 8 .0 8 .5 9 .0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 pH G A B A ( m M ) Hình 13: Ảnh hƣởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá
trình lên men dịch chiết cám gạo
3.1.8.2. Nhiệt độ thích hợp cho lên men.
Đối với các vi sinh vật việc thay đổi nhiệt độ sẽ ảnh hƣởng mạnh tới khả năng phát triển và có thể ảnh hƣởng trực tiếp lên những sản phẩm thứ cấp sinh ra từ các vi sinh vật này. Do vậy, việc xác định nhiệt độ tối ƣu cho quá trình lên men môi trƣờng dịch cám gạo bằng Lactobacillus plantarum KLEPT để sinh GABA có vai trò rất quan trọng đến hiệu quả sản xuất. Quá trình lên men đƣợc đặt tại các dải nhiệt độ khác nhau theo phần phƣơng pháp. Dịch sau khi lên men đƣợc ly tâm và đánh giá hàm lƣợng GABA theo phần phƣơng pháp. Kết quả đƣợc chỉ ra ở hình 14, nhiệt độ ảnh hƣởng rất mạnh tới quá trình sinh ra GABA. Khi nhiệt độ thấp hoặc cao thì khả năng sinh GABA sẽ giảm mạnh. Bởi vì tại nhiệt độ này thƣờng không thích hợp đối với điều kiện sinh trƣởng của các vi khuẩn lactic hay Lactobacillus plantarum
KLEPT. Ở hình 14 cho thấy rõ ở nhiệt độ 34°C thì lƣợng GABA đƣợc sinh ra cao nhất với nồng độ là 252 mM.
42 0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 t ° ( ° C ) G A B A ( m M )
Hình 14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo.
3.1.8.3. Thời gian thích hợp cho lên men
Thời gian lên men sẽ ảnh hƣởng mạnh tới hiệu suất của quá trình lên men. Khi thời gian lên men ít thì hàm lƣợng GABA sẽ chƣa sinh ra hoặc vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu suất tối đa. Nhƣng thời gian lên men kéo dài quá cũng ảnh hƣởng tới chất lƣợng của sản phẩm cần quan tâm và hiệu quả kinh tế bị ảnh hƣởng mạnh. Chính vì vậy, dịch cám gạo sau khi đã xử lý nhƣ phần phƣơng pháp đƣợc tiến hành thu mẫu ở các thời điểm khác nhau nhƣ phần phƣơng pháp, sau đó đem đánh giá hàm lƣợng GABA. Kết quả thu đƣợc ở hình 15, sau 24 giờ đã xuất hiện GABA có trong dịch lên men. Tuy nhiên, hàm lƣợng này tăng dần theo các điểm thời gian và dừng lại sau 96 giờ. Còn ở 120 giờ thì hàm lƣợng GABA đã có xu hƣớng giảm nhẹ. Từ kết quả này chỉ ra lƣợng GABA sinh ra cao nhất là 193 mM khi lên men kéo dài sau 96 giờ.
43 0 2 4 4 8 7 2 9 6 1 2 0 1 4 4 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 t im e ( h ) G A B A ( m M )
Hình 15:Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo.
3.1.8.4. Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men
Lactobacillus plantarum KLEPT (KC1) là vi khuẩn lactic phát triển đƣợc cần không khí. Do vậy, để cho KC1 phát triển mạnh nhất và làm tăng hoạt tính mạnh nhất thì việc khảo sát tỉ lệ ôxy cung cấp vào môi trƣờng lên men là rất cần thiết. Quá trình lên men bằng dịch cám gạo đã đƣợc theo dõi ở các tỉ lệ ôxy khác nhau nhƣ phần phƣơng pháp. Kết quả chỉ ra ở hình 16. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng GABA phụ thuộc khá mạnh vào tỉ lệ ôxy cung cấp thêm vào dịch lên men. Khi tỉ lệ ôxy thấp thì lƣợng GABA sinh ra thấp và ngƣợc lại. Tuy nhiên, khi tỉ lệ ôxy quá cao thì hàm lƣợng GABA lại có xu hƣớng giảm đi. Điều này có thể do vi khuẩn bị ức chế quá trình sinh trƣởng và hoạt tính GAD bị ức chế. Với tỉ lệ 40% ôxy cho hàm lƣợng GABA cao nhất là 198 mM trong quá trình lên men dịch cám gạo bằng KC1.
44 0 2 0 4 0 6 0 8 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 O2( % ) G A B A ( m M )
Hình 16: Ảnh hƣởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo
45
3.1.9. Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo
Từ các điều kiện tối ƣu đã tìm đƣợc ở trên cho phép đƣa ra sơ đồ quy trình lên men dịch cám gạo tối ƣu trên hình 17.
Cám gạo đã loại dầu + H2O (tỉ lệ 1:5)
Hoạt hóa KC1 từ ống thạch nghiêng Thu dịch đánh giá lƣợng GABA tạo thành Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo
Ly tâm 5000 vòng/phút, 15 phút Nhân chủng cấp 1
Xử lý nhiệt 130ºC, trong thiết bị khử trùng
Làm lạnh, ly tâm
Dịch thu đƣợc bổ sung H2O
Bổ sung thêm 1% NaCl, 1% cao nấm men, 1% glucose, 12% mỳ chính
Lên men (pH 6,5; 34ºC, 40% O2, 96 giờ, 1% chủng
46
3.2. Đánh giá hoạt tính của GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Sau khi tiến hành lên men theo quy trình trên, dịch lên men đƣợc đông khô và tinh chế để thu GABA nguyên chất thu đƣợc kết quả trên hình 18. Sử dụng GABA tinh chế và GABA chuẩn tiến hành kiểm tra bằng chạy sắc ký bản mỏng thu đƣợc kết quả trong hình 19, dịch lên men sau khi tinh chế cho hàm lƣợng GABA không còn tạp chất và hàm lƣợng tƣơng đƣơng GABA chuẩn. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể kết luận đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp cho lên men sản xuất GABA trên môi trƣờng cám gạo thành công.
A B
Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B)
1 2 3
Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC
1: GABA chuẩn, 2:GABA và MSG, 3: GABA dịch lên men sau khi tinh chế GABA
47
3.3. Đánh giá hoạt tính của GABA
3.3.1. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12
Để khẳng định GABA sinh ra đƣợc từ chủng Lactobacillus plantarum
KLEPT có hoạt tính sinh học, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính của GABA sinh ra thông qua việc đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12 (dòng tế bào đƣợc phân lập từ hệ thần kinh chuột). Sau khi tế bào PC12 đã đƣợc hoạt hóa ở tủ nuôi cấy tế bào trong 24 giờ, các tế bào này đƣợc chia vào đĩa 96 giếng và đƣợc nuôi tiếp trong tủ nuôi tế bào. Sau 24 giờ, các tế bào này sẽ đƣợc bổ sung dịch lên men có GABA. Sau 60 phút, bổ sung thêm H2O2 với nồng độ nhƣ đã chỉ ra ở phần phƣơng pháp [2.2.3.1]. Sau 24 giờ, sử dụng kit để đánh giá khả năng sống chết của tế bào sau khi đƣợc tiền xử lý và không tiền xử lý cùng với GABA. Hình 20 là kết quả sau khi đánh giá mật độ sống chết của tế bào. Từ kết quả này cho thấy ở nồng độ 20 µl/ml dịch lên men có chứa GABA thì khả năng tế bào sống đã đƣợc cải thiện hơn rất nhiều so với tế bào không đƣợc tiền xử lý cùng với dịch lên men có chứa GABA gần 90%. Với nồng độ 50 µl/ml dịch lên men có chứa GABA thì khả năng sống của tế bào đã đƣợc cải thiện gần nhƣ 100% so với tế bào không đƣợc tiền xử lý trƣớc