3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1
Việc nuôi tế bào WSS-1 phát triển là một vấn đề quyết định đến quá trình thử hoạt tính của GABA. Chính vì vậy, tế bào đã đƣợc tiến hành nuôi cấy trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt và theo phần phƣơng pháp. Sau khi tế bào đƣợc nuôi trong tủ nuôi cấy tế bào với tỉ lệ CO2 là 5%, nhiệt độ 37°C và đƣợc quan sát trên kính hiển vi. Kết quả trên hình 26A cho thấy tế bào dính kết và tăng sinh nhiều sau 24 giờ. Tỉ lệ tế bào này tiếp tục tăng sinh lên sau 48 giờ (hình 26B).
0 2500000 5000000 7500000 10000000 12500000 15000000 Area 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5
53 .
A B
Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy (A), sau 48 giờ nuôi cấy (B)
3.3.3.2. Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào WSS-1 WSS-1
Việc đánh giá hoạt tính của GABA sau khi sản xuất sẽ quyết định chất lƣợng toàn bộ công nghệ sản xuất lên men từ dịch cám gạo bởi vì nếu sản phẩm tạo ra không có hoạt tính thì sản phẩm sẽ không có ý nghĩa về dƣợc tính và sẽ không có tác động đến điều trị bệnh. Chính vì vậy, việc đánh giá hoạt tính dựa ngay vào tác động của thụ thể GABA trên dòng tế bào WSS-1 có một ý nghĩa vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã áp dụng dòng tế bào này trong việc xác định hoạt tính sinh học của dịch GABA sau khi lên men. Tế bào đƣợc phân chia vào các giếng trên đĩa 96 giếng và thao tác theo phần phƣơng pháp. Tế bào trong các giếng của đĩa 96 đƣợc đem đo khả năng hấp thụ quang học ở bƣớc sóng 405 nm. Kết quả đọc đƣợc ghi lại và sử dụng phần Xcell cho kết quả ở hình 27. Từ kết quả này cho thấy, tế bào không đƣợc xử lý bằng GABA thì khả năng hấp thụ Iot là gần nhƣ bằng 0. Tuy nhiên, khi tế bào đƣợc xử lý bằng GABA chuẩn và các nồng độ GABA lên men ở dạng thô thì khả năng thay đổi màu của Iot là rất rõ ràng.
54
Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên men
3.3.3.3. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot
Phƣơng pháp định lƣợng GABA bằng so màu thông thƣờng cho kết quả chính xác và đã đƣợc áp dụng từ nhiều năm. Tuy nhiên, việc định lƣợng này không tác động lên đích thực sự của hoạt động tế bào. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp định lƣợng GABA trong dịch lên men bằng phƣơng pháp so màu với Iôt để từ mật độ quang thu đƣợc sẽ suy ra nồng độ GABA và đánh giá luôn đƣợc hoạt tính. Điều này có vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển thực phẩm chức năng để xác định sản phẩm có tác động thực sự lên đích của tế bào hay không. Để đánh giá đƣợc chính xác hàm lƣợng GABA đƣợc tạo thành trong dịch lên men cần phải xây dựng một đƣờng chuẩn của GABA. Dựa vào đƣờng chuẩn này sẽ đo đƣợc hàm lƣợng GABA trong dịch lên men bằng cách suy ra từ mật độ quang thu đƣợc.
Xây dựng đường chuẩn
Một dải nồng độ GABA đã đƣợc pha nhƣ phần phƣơng pháp. Sau đó, các nồng độ này đƣợc đƣa vào đĩa có chứa tế bào WSS-1. Sau đó, các tế bào này đƣợc đem đánh giá khả năng hấp thụ màu ở bƣớc sóng 405 trên máy ELISA 6860. Kết
55
quả này đã cho đƣờng chuẩn GABA (hình 28). Dựa vào đƣờng chuẩn này, chúng tôi suy ra đƣợc nồng độ GABA của mẫu cần đo.
Hình 28: Đƣờng chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bƣớc sóng 405 nm
Xác định hàm lượng GABA trong dịch lên men
Để đánh giá đƣợc độ chính xác của phƣơng pháp định lƣợng thông qua thụ thể GABA và phƣơng pháp so màu. Chúng tôi đã lấy mẫu lên men đo bằng hai phƣơng pháp. Kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 9. Từ kết quả này cho thấy hàm lƣợng GABA đo bằng cả hai phƣơng pháp là không có sự khác nhau. Nhƣ vậy, phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng GABA thông qua thụ thể có thể đƣợc áp dụng vì phƣơng pháp này so với phƣơng pháp so màu cho kết quả giống nhau ngoài ra phƣơng pháp này có khả năng đánh giá đƣợc hoạt tính của GABA trực tiếp trên tế bào.
Bảng 9: Hàm lƣợng GABA trong dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo
y = 0.0003x + 0.9097 R² = 0.9824 0.9 0.95 1 1.05 1.1 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ GABA (mM)
Phƣơng pháp đánh giá GABA (mM)
so màu thông thƣờng 672
so màu iot 670
56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Đề tài đã hoàn thành với các kết quả chính nhƣ sau:
1. Quy trình lên men từ chủng Lactobacillus plantarum KLEPT trên môi trƣờng dịch cám gạo sẽ đạt hiệu quả nhất khi bổ sung thêm 1% NaCl, 1% glucose, 1% cao nấm men, 12% mỳ chính cho 10 lít dịch lên men.
2. Xác định đƣợc các thông số chính dùng lên men GABA thích hợp nhất là pH 6,5; nhiệt độ 340C; thời gian 96 h; tỉ lệ oxi 40%.
3. Đánh giá hoạt tính của GABA trực tiếp trên tế bào theo phƣơng pháp so màu Iot cho kết quả tƣơng đƣơng với phƣơng pháp so màu thông thƣờng.
Kiến nghị
1. Tiếp tục hoàn thiện phƣơng pháp tinh chế GABA bằng công nghệ kết tinh. 2. Bƣớc đầu đánh giá hiệu quả GABA trên động vật và ngƣời.
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt:
1. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và kĩ thuật.
2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục. 3. Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sƣ phạm
Hà Nội.
4. Nguyễn Xuân Thắng (2002), Receptor màng tế bào và tác dụng của thuốc, NXB Y học, Hà Nội.
Tiếng anh:
5. Abe Y., Umemura S., Sugimoto K.I., Hirawa N., Kato Y., Yokoyama N. Yokoyama T., Junichi I., Masao I (1995), “Effect of green tea rich in γ - aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American Journal of Hypertens 8(1), 74-79.
6. Ali F.W.O., Abdulamir A.S., Mohammed A.S., Bakar F.A., Manap Y.A., Zulkifli A.H., Saari N (2009), “Novel, Practical and Cheap Source for Isolating Beneficial gamma-Aminobutyric Acid-Producing Leuconostoc NC5 Bacteria”,
Research Journal of Medical Science,3(4). 146-153.
7. Bautista G.M., Lugay J.C., Cruz L.J., Juliano B.O. (1964), “Glutamic acid decarboxylase activity as a viability index of artificial dried and stored rice”,
Cereal Chem, 41. 188-191.
8. Cagno R. D., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D. (2009), “Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by
Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, 86. 731-741.
9. Connor M.A., Saunders R.M., Kohler G.O. (1977), “Preparation and properties of protein concentrates obtained by wet alkali processing of rice bran”, Rice By- products Utilization International Conference, IACFT, Spain.
58
10.Cross M. L. (2004), “Immune-signaling by orally-delivered probiotic bacteria: Effects on common mucosal immunoresponses and protection at distal mucosal sites”, J. Immunopathol. Pharmacol, 17. 127-134.
11.Chin H.S., Breidt F., Fleming H.P., Shin W.C., Yoon S.S (2006), “Identification of predominant bacterial isolates from the fermenting kimchi using ITS-PCR and partial 16S rDNA sequence analyses”, J. Microbiol. Biotechnol,16. 68-76. 12.Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C. (2007), “Production of gamma-aminobutyric
acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells”, J. Microbiol Biotechnol, 17. 104-109. 13. Choi S. I., Lee J. W., Park S. M., Lee M. Y., Ji G. E., Park M. S., Heo T. R
(2006), “Improvement of γ-aminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis”, J. Microbiol. Biotechnol, 16. 562-568. 14. Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., De Angelis M., Giuliani G., Meloni
M., De Servi B., Gobbetti M. (2009), "Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications", Appl Microbiol Biotechnol, 86. 41- 731.
15. Foester C.W., Foester H. F. (1973), “Glutamic acid decarboxylase in spores of
Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination”, J. Bacteriol, 114. 1090-1098.
16. Hayakawa K., Masayuki K., Yamori Y. (2005), “Role of the renal nerves in γ- aminobutyric acid-induced anti-hypertensive effect in spontaneously hypertensive rats”, European Journal of Pharmacology, 524. 120-125.
17. Inglese J. (2007), “High-throughput screening assays for the identification of chemical probes”, Nature chemical biology, 3. 466-479.
18. Jannoey P., Niamsup H., Lumyong S., Tajima S., Nomura M., Chairote G. (2010), “γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulations in Rice During Germination”, Chiang Mai J, 37(1). 124-133.
59
19. Jeun J.H., Kim H.D., Lee H.S., Ryu B.H. (2004), “Isolation and identification of Lactobacillus sp produced γ-aminobutyric acid (GABA) from traditional salt fermented anchovy”, Kor. J. Food Nutr, 1. 72-79.
20. Jin Z., Mendu S.K., Birnir B. (2011), GABA is an effective immunomodulatory molecule, Amino Acids, 45. 87-94.
21. Kang M.S., Cho S.C., Kook M.C., Pyun Y.R., Choi C.I. (2006), “Novel strains of Lactobacillus spp and method for preparing γ-aminobutyric acid using the same”, Korea. Patent. 10-0549094.
22. Kayahara H., Sugiura T. (2001), “Research on physiological function of GABA in recent years-improvement function of brain function and anti-hypertension”,
Japanese Journal of Food development, 36(6). 4-6.
23. Kim S.H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J. (2007), “Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2”, Biotechnol Bioprocess Eng, 12. 707-712.
24. Kinefuchi M., Sekiya M., Yamazaki A., Yamamoto K. (1999), “Accumulation of GABA in brown rice by high pressure treatment”, Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 46. 323-328.
25. Komatsuzake N., Kawamoto S., Momose H., Kimura T. (2005), "Production of γ aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods", Food Microbiol, 22. 497-504.
26. Komatsuzake N., Shima J., Kawamoto S., Momose H., Kimura T. (2005), “Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods”, Food Microbial, 22. 497-504.
27. Kono I., Himeno K. (2000), “Changes in γ-aminobutyric acid content during beni-koji making”, Biosci. Biotechnol. Biochem, 64. 617-619.
28. Kook M.C. (2010), “Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16”, J. Microbiol. Biotechnol, 20(4). 763-766.
60
29. Lee H.Y., Park J.H., Seok S.H., Choi S.A., Baek M.W., Kim D.J., Lee Y., Park J.H. (2004), “ Dietary intake of various lactic acid bacteria suppresses type 2 helper T cell production in antigen-primed mice splenocyte”, J. Microbiol. Biotechnol, 14. 167-170.
30. Leroy F., De Vuyst L. (2004), “Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry”, Trends Food Sci Technol, 15. 67-78.
31. Li H., Qiu T., Chen Y. (2011), “Separation of gamma-aminobutyric acid from fermented broth”, J Ind Microbiol Biotechnol, 38. 1955-1959.
32. H.X., Gao D.D., Cao Y.S., Xu H.Y. (2008), “A high γ-aminobutyric acid- producing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai”, Ann. Microbiol, 58. 649-653.
33. Manyam B.V., Katz L., Hare T.A., Kaniefski K., Tremblay R.D. (1981), “Isoniazid-induced elevation of cerebrospinal fluid (CSF) GABA levels and effects on chorea in Huntington’s disease”, Ann. Neurol, 10. 35-37.
34. Nomura M., Fujita Y., Kobayashi M., Kimoto H., Suzuki I., Aso H. (1999), "Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene", Microbiology,145. 1375-1380.
35. Nomura M., Kimoto H., Someya Y., Furukawa S., Suzuki I. (1998), “Production of gamma-aminobutyric acid by cheese starters during cheese ripening”, J Dairy Sci, 81. 1486-1491.
36. Ohtsubo S., Asano S., Sato K., Matsumoto I. (2000), “Enzymatic Production of v-Aminobutyric Acid Using Rice (Oryza sativa) Germ”, Food Sci. Technol. Res, 29. 208-211.
37. Park K.B., Oh S.H. (2007), “ Production of yogurt with enhanced levels of gamma-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract”, Bioresource Technolology, 98(8). 1675-1679. 38. Park O. (2007), "Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate
decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3", Elsevier, 312-329.
61
39. Parkash J., Kaur G (2007), “ Potential of PSA-NCAM in neuron-glial plasticity in the adult hypothalamus: Role of noradrenergic and GABAergic neurotransmitters”, Brain Research Bulletin, 74. 317-328.
40. Peter T. Bosma., Martin A. Collins., John D.D. Bishop., I.G.P. Guy Drouin., Kevin Docherty., Vance L. Trudeau. (1999), "Multiplicity of Glutamic Acid Decarboxylases (GAD) in Vertebrates: Molecular Phylogeny and Evidence for a New GAD Paralog", Soc. Mol. Biol. Evol. 397-404.
41. Qui T., Li H., Cao Y. (2010), “Pre-staining thin layer chromatography method for amino acid detection”, Afr. J. Biotechnol, 9. 8679-8681.
42. Ratanaburee A., Kantachote D., Charernjiratraku., Penjamras P., Chaiyasut C (2011), “ Enhancement of γ-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DW12”, Electronic Journal of Biotechnology,14. 0717-3458.
43. Roberts K.A., Wright J.W., Harding J.W. (1993), “GABA and bicuculline- induced blood pressure changes in spontaneously hypertensive rats”, J. Cardiovasc. Pharmacol, 21. 156-162.
44. Sereewatthanawut I., Prapintip S., Watchiraruji., Goto M., Sasaki M., Shotipruk A. (2006), “Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis”, Bioresource Technology, 99. 555-561.
45. Siragusa S., De Angelis M., Di Cagno R., Rizzello C.G., Coda R., Gobbetti M. (2007), “Synthesis of gamma-Aminobutyric Acid by Lactic Acid Bacteria Isolated from a Variety of Italian Cheeses”, Applied and Environmental Microbiology, 73. 7283-7290.
46. Stanton H.C (1963), “Mode of action of gamma amino butyric acid on the cardiovascular system”, Arch. Int. Pharmacodyn, 143, tr. 195-204.
47. Sun T.S., Zhao S.P., Wang H.K., Cai C.K., Chen Y.F., Zhang H.P. (2009), “ACE-inhibitory activity and gamma-aminobutyric acid content of fermented skim milk by Lactobacillus helveticus isolated from Xinjiang koumiss in China”, Eur. Food Res. Technol, 228. 607-612.
62
48. Sun Z., Chen X., Wang J., Zhao W., Shao Y., Guo Z., Zhang X., Zhou Z., Sun T., Wang L., Meng H., Zhang H., Chen W. (2011), "Complete Genome Sequence of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Strain ND02", J. Bacteriol, 193(13). 3426-3427.
49. Tang W, Wildey M.J. (2004), “Development of a colorimetric method for functional chloride channel assay”, J. Biomolecular Screening, 9. 607-613. 50. Tsai J.S., Lin Y.S., Pan B.S., Chen T.J. (2006), “ Antihypertensive peptides and
gamma-aminobutyric acid from prozyme 6 facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk”, Process Biochem, 41. 1282-1288.
51. Ueda Y., Doi T., Nagatomo K., Tokumaru J., Takaki M., Willmore L.J. (2007), “Effect of levetiracetam on molecular regulation of hippocampal glutamate and GABA transporters in rats with chronic seizures in-duced by amygdalar FeCl3 injection”, Brain Research, 1151. 55-61.
52. Waagepetersen S. (2004), Gamma-aminobutyric acid (GABA), sciencedirect. 53. Wang M., Hettiarchchy N.S., Qi M., Burks W., Siebenmorgen T. (1999),
“Preparation and functional properties of rice bran protein isolate”, J. Agric. Food Chem, 47. 411-416.
54. Wong C.G., Bottiglieri T., Snead O.C. (2003), “GABA, γ-hydroxybutyric acid and neurological disease”, Ann. Neurol, 54. S3-S12.
55. Yamakoshi J., Fukuda S., Satoh T., Tsuji R., Salto M., Obata A., Matsuyama A., Kikuchi M., Kawasaki T. (2007), “Antihypertensive and natriuretic effect of less-sodium soy sauce containing gamma-aminobutyric acid in spontaneously hypertensive rats”, Biosci Biotechnol Biochem, 71. 165-173.
56. Yang S.Y., Lu F.X., Lu Z.X., Bie X.M., Jiao Y, Sun L.J, Yu B. (2008), “Production of gamma-aminobutyric acid by Streptococcus salivariussubsp thermophilus Y2 under submerged fermentation”, Amino Acids, 34. 473-478. 57. Zhang G., Bown A.W. (1997), “The rapid determination of γ-aminobutyric acid”,
Phytochemistry, 44. 1007-1009.
63
59. <http://en.wikipedia.org/wiki/GABA_receptor> 60. <http://vi.wikipedia.org/wiki/Mononatri_glutamat>