NGHIÊN cứu QUY TRÌNH sản XUẤT γ AMINOBUTYRIC AXIT từ DỊCH cám gạo BẰNG LACTOBACILLUS

Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA .... MỞ ĐẦU γ-Aminobutyric axit GABA là một axít amin có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh.. Hiện nay, quá trình

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

i

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Tất Cường là

người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Sinh học làm

cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh, chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014

Học viên

Lý Thị Kim Tuyến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA) 11

1.2 Cấu trúc và hình dạng của GABA 11

1.3 Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não 12

1.4 Enzym tổng hợp GABA 13

1.5 Thụ thể GABA 14

1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật 15

1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA 17

1.8 Thực phẩm chức năng GABA 18

1.8.1 Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA 18

1.8.2 Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam Error! Bookmark not defined

1.9 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

2.1 NGUYÊN LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Các mẫu cám gạo Error! Bookmark not defined 2.1.3 Các dòng tế bào Error! Bookmark not defined 2.1.4 Máy móc và dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.1.5 Các hóa chất, nguyên liệu khác Error! Bookmark not defined

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo Error! Bookmark not defined

2.2.1.1 Nuôi cấy và bảo quản chủng KC1 Error! Bookmark not defined 2.2.1.2 Kiểm tra khả năng sinh GABA của chủng KC1 Error! Bookmark not defined

iii

2.2.1.3 Đánh giá chất lượng cám gạo Error! Bookmark not defined 2.2.1.4 Xác định hoạt tính của glutamate decacboxylase trong cám gạo Error! Bookmark not defined

2.2.1.5 Xác định glutamic axit bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Error! Bookmark not defined

2.2.1.6 Định lượng glutamic acid bằng phương pháp so màu Error! Bookmark not defined

2.2.1.7 Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phương pháp nước sôi

Error! Bookmark not defined

2.2.1.8 Xác định GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41]

Error! Bookmark not defined

2.2.1.9 Định lượng GABA bằng phương pháp so màu [57] Error! Bookmark not defined

2.2.1.10 Xác định nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men Error! Bookmark not defined

2.2.1.11 Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trường dịch cám gạo

Error! Bookmark not defined

2.2.2 Tinh chế GABA [31] Error! Bookmark not defined 2.2.2.1 Khử màu Error! Bookmark not defined 2.2.2.2 Khử muối Error! Bookmark not defined 2.2.2.3 Chạy sắc ký trao đổi ion Error! Bookmark not defined 2.2.2.4 Kết tinh GABA Error! Bookmark not defined 2.2.3 Đánh giá hoạt tính GABA Error! Bookmark not defined 2.2.3.1 Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12 Error! Bookmark not defined 2.2.3.2 Đánh giá khả năng sống chết của tế bào Error! Bookmark not defined

2.2.3.3 Xác định GABA bằng phương pháp HPLC [42] Error! Bookmark not defined

2.2.3.4 Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49] Error! Bookmark not defined

2.2.3.5 Định lượng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

3.1 Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.1 Khả năng sinh GABA của chủng KC1 Error! Bookmark not defined 3.1.2 Các chỉ tiêu chất lượng và an toàn thực phẩm của cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.3 Đánh giá hoạt động của GAD trong cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.4 Xác định thành phần và lựa chọn nguyên liệu cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.4.1 Xác định định tính glutamic acid trong hai mẫu cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.4.2 Định lượng glutamic acid trong hai mẫu cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.5 Lượng glutamic acid thu được bằng phương pháp nước sôi Error! Bookmark not defined

3.1.6 Đường chuẩn GABA xác định hàm lượng GABA bằng phương pháp so

màu Er ror! Bookmark not defined

3.1.7 Nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8 Các điều kiện lên men thích hợp trên môi trường dịch cám gạo Error! Bookmark not defined

3.1.8.1 pH thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8.3 Thời gian thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8.4 Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.9 Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo Error! Bookmark not defined

3.2 Đánh giá hoạt tính của GABA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng Error! Bookmark not defined

3.3 Đánh giá hoạt tính của GABA Error! Bookmark not defined

Bookmark not defined

3.3.3.1 Nuôi cấy tế bào WSS-1 Error! Bookmark not defined

3.3.3.2 Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào WSS-

1 Error! Bookmark not defined

3.3.3.3 Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot Error! Bookmark not defined

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

HTS Phương pháp sàng lọc High throughput

screening KC1 Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Cấu trúc của GABA 4 Hình 2 Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA 5 Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA 6

vii

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB 7

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trước và sau khi gắn kết với GABA 7

Hình 6: Kết quả chạy sắc ký TCL đối với dịch lên men trên môi trường MRS 29

Hình 7: Hoạt tính GAD trong cám gạo được xác định thông qua MSG 31

Hình 8: Kết quả xác định glutamic acid trong cám gạo bằng TLC 32

Hình 9: Đường chuẩn glutamic acid 33

Hình 10: Hiệu quả nhiệt độ và thời gian đối với quá trình thủy phân glutamic acid từ cám gạo 35

Hình 11: Đường chuẩn GABA 36

Hình 12: Hiệu quả của NaCl trên quá trình phát triển tế bào và sản xuất GABA 37

Hình 13: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 41

Hình 14: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 42

Hình 15: Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 43

Hình 16: Ảnh hưởng của ôxy tới quá trình sản xuất GABA trong quá trình lên men dịch chiết cám gạo 44

Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo 45

Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B) 46

Hình 19: Kiểm tra GABA bằng TLC 46

Hình 20: Khả năng bảo vệ tế bào PC12 của dịch lên men chủng Lactobacillus-plantarum KLEPT 48

Hình 21: Sắc ký đồ của GABA chuẩn 49

Hình 22: Xây dựng đường chuẩn GABA qua HPLC 49

Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men 50

Hình 24: Chạy các phân đoạn tách chiết bằng sắc ký cột 51

Hình 25: Đưa mẫu GABA tinh sạch vào đường chuẩn để xác định độ tinh sạch của

mẫu 52

Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dưới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy tế bào WSS-1 (A), sau 48 giờ (B) 53

Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên men 54

Hình 28: Đường chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bước sóng 405nm 55

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Thành phần môi trường MRS 15

Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng của hai mẫu cám gạo 30

Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo 33

Bảng 5: Lượng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon 38

Bảng 6: Lượng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ 39

ix

Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hưởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi trường 40 Bảng 8: Hàm lượng GABA trong dịch lên men theo hai phương pháp đo 55

MỞ ĐẦU

γ-Aminobutyric axit (GABA) là một axít amin có chức năng quan trọng trong

hệ thống thần kinh GABA thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua khe xináp và giữ liên lạc các tế bào với nhau trong hệ thống thần kinh trung ương Ngoài ra, GABA đã được biết có hiệu quả điều hòa một số rối loạn thần kinh giống như bệnh Parkinson, Huntington và bệnh Alzheimer Chính vì GABA có những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tương bằng vi sinh vật Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới Đặc biệt, vi khuẩn axít lactic đã được ứng dụng để lên men cho hàm lượng lớn GABA từ thực phẩm truyền thống và đã tối ưu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với mục tiêu công nghiệp

Tại Việt Nam, có thể nói chưa có công nghệ chế biến GABA có khả năng hướng tới quy mô công nghiệp Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất GABA đã được nghiên cứu nhưng vẫn chưa có sản phẩm GABA bán ra thị trường Ngoài ra cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn

Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích

miễn dịch ổn định ở Việt Nam

Hiện nay, hướng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam Thực tế, khi một sản phẩm có thể tiếp cận được trên thị trường thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lượng và giá thành Để giải quyết hai vấn đề lớn này, hướng nghiên cứu của đề tài là chọn một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có nhất ở trong nước mà vẫn cung cấp được đầy đủ các thành phần cơ bản để có thể lên men được GABA có hiệu suất cao

Về chất lượng sản phẩm, nhóm nghiên cứu đề tài đã sử dụng chất chỉ thị chỉ ra được sự thay đổi kênh ion clorua để kiểm tra hoạt tính của tế bào

11

Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo

bằng Lactobacillus”

Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu:

+ Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng

chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ

+ Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA)

GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao như khoai tây, đậu tương, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi

Trong cơ thể, GABA được phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ương vào khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhưng đến năm 1960, GABA mới được đề xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể Ngoài não, GABA cũng có mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa GABA có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5] Hoạt động của GABA cùng với glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ thống thần kinh trung ương [20, 51]

Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con người:

- Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn

- Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và hiện tượng mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân Trong những trường hợp này,

bổ sung thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần kinh tại não bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân

- Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng có thể làm gia tăng sự đau nhức Như một chất dẫn tự nhiên có chức năng giảm stress, GABA có thể giảm bớt tình trạng đau nhức kéo dài khi giảm các dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho chúng ta bớt cảm giác về sự đau nhức đó

- Giảm trầm cảm

- Việc sử dụng các loại thuốc an thần làm giảm lượng GABA trong cơ thể

và là một trong các nguyên nhân gây ra hiện tượng hoảng loạn

- GABA cũng được coi là có thể điều trị được trạng thái rối loạn tâm lý trước thời kỳ kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) đối với phụ nữ

1.2 Cấu trúc và hình dạng của GABA

GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin nhận proton (hình 1) Hình dạng của GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện của môi

13

trường Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo ra sức hút điện tích giữa hai nhóm chức năng amin và cacbon Theo tính toán hóa học để phá vỡ cấu trúc này cần một năng lượng khoảng 50 kcal/mol Ở trạng thái rắn, GABA luôn có hình dạng mạch thẳng Dưới dạng mạch thẳng, GABA luôn có cấu trúc hình học trans ở nhóm amin cuối và dạng cis ở nhóm cacbon kết thúc Cấu trúc này sẽ giúp cho phân tử GABA liên kết dễ dàng với các phân tử GABA khác Ở trạng thái lỏng, GABA tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng Chính nhờ khả năng tồn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có nhiều chức năng sinh học quan trọng [20, 22]

Hình 1: Cấu trúc của GABA [58]

1.3 Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não

GABA tham gia vào nhiều quá trình của hệ thống thần kinh trung ương Chẳng hạn như liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA không thể xuyên qua được hàng rào để vào trong não Do vậy, GABA được tổng hợp trong não bằng con đường trao đổi chất được biết là “GABA shunt” (hình 2) Giai đoạn cuối của con đường này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate bằng sự phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín hiệu thần kinh [20, 22]

Khi lượng GABA được sinh ra vượt quá ngưỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh sẽ được một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm giảm bớt [20] Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde succinic nhưng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA Ngoài ra, những chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lượng lớn GABA ở trong não [20] Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin

B6 hay còn được gọi là pyridoxal-5’-phophate được xem như một cofactor [32] Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não

Hình 2: Con đường tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]

GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các neuron thần kinh GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ương bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20]

Do vậy, GABA giúp cho thư giãn thần kinh và cải thiện được tinh thần Cho tới nay, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con người

có giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài, rối loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trước thời kỳ kinh nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54]

1.4 Enzym tổng hợp GABA

L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO2 GAD tồn tại dưới hai dạng đồng phân là GAD65 và GAD67 theo khối lượng phân tử của chúng (lần lượt là 65 và 67 kDa) Chúng được mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số

10 ở người, gen GAD65 nằm trên NST số 10 và gen GAD67 nằm trên NST số 2 [20, 40] GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic trong cơ thể Ngược lại, GAD65 chủ yếu được tìm thấy ở tận cùng các dây thần