Nghiên cứu quy trình sản xuất vawcxin bất hoạt tụ huyết trùng gia lâm cầm nhũ dầu quy mô phòng thí nghiệm

Như vậy, việc nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật nhằm nâng cao chất lượng văc xin với hai chỉ tiêu quan trọng là hiệu lực và ñộ dài miễn dịch là việc làm cần thiết và cấp bách nhằm kiểm s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

HOÀNG VĂN KHOẢN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VĂC XIN BẤT HOẠT TỤ HUYẾT TRÙNG GIA CẦM NHŨ DẦU

QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan:

Các kết quả nghiên cứu thể hiện trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chưa ñược

sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà nội, ngày … tháng 10 năm 2013

Tác giả luận văn

Hoàng Văn Khoản

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành ựề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hướng dẫn:

PGS.TS Nguyễn Viết Không - Phó viện trưởng, Viện Thú y Quốc gia

TS Nguyễn Bá Tiếp - Trưởng Bộ môn Giải phẫu - Tổ chức, Khoa Thú y,

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

ựề tài cũng như trong quá trình hoàn thiện luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

- Các thầy cô và cán bộ giảng dạy của Khoa Thú y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tận tình giảng dạy, truyền ựạt ựầy ựủ kiến thức chuyên môn cần thiết cho chúng tôi trong quá trình học tập tại trường

- Ban lãnh ựạo và toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Chuyển giao công nghệ thú y - Viện Thú y Quốc gia ựã tạo ựiều kiện tốt nhất giúp tôi triển khai và thực hiện ựề tài tại Trung tâm

- Gia ựình, bạn bè và ựồng nghiệp ựã luôn ựộng viên và giúp ựỡ tôi về tinh thần, vật chất và chuyên môn trong quá trình học tập và thực hiện ựề tài tốt nghiệp

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày Ầ tháng 10 năm 2013

Hoàng Văn Khoản

1.3.2 đặc tắnh nuôi cấy của Pasteurella multocida 7

1.3.3 đặc tắnh sinh hóa của Pasteurella multocida 8

1.3.4 Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 10

1.3.5 độc tố của vi khuẩn Pasteurella multocida 11

1.3.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 11 1.4 Bệnh tụ huyết trùng gia cầm 15

1.4.2 đặc tắnh gây bệnh và ựộc lực 15 1.4.3 đường xâm nhập và phương thức truyền bệnh 15 1.4.4 Lứa tuổi mắc và tỷ lệ tử vong 16 1.4.5 động vật cảm thụ 16 1.4.6 Nguồn bệnh và phương thức lây truyền bệnh 16

1.4.7 Các loại kháng nguyên P.multocida 17 1.4.8 đáp ứng miễn dịch trong bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 19 1.5 Văc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 21 1.5.1 Quá trình phát triển văc xin phòng Tụ huyết trùng 21

1.5.2 Chất bổ trợ văc xin 22 1.5.3 Ứng dụng công nghệ tiên tiến trong sản xuất văc xin 23 1.5.4 Các loại văc xin Tụ huyết trùng gia cầm 24

2 CHƯƠNG II NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 ðối tượng và nội dung 27

3.1 Kết quả kiểm ñịnh giống sản xuất P.multocida N41 35 3.2 Giải pháp kỹ thuật tối ưu hóa hiệu quả lên men sinh khối 37 3.2.1 Ảnh hưởng của chất lượng môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn 37 3.2.2 Xác ñịnh hàm lượng oxy hòa tan (DO) tối ưu 41 3.3 Kết quả thử nghiệm, lựa chọn chất bổ trợ phù hợp 43 3.4 Sản xuất thử nghiệm văc xin tụ huyết trùng gia cầm nhũ dầu 47 3.5 ðặc tính sinh miễn dịch của kháng nguyên trong văc xin nhũ dầu 50

3.5.1 Mức ñộ ñáp ứng miễn dịch theo thời gian 50 3.5.2 Kết quả giám sát ñộ dài miễn dịch 53

5.1 Tài liệu tiếng Việt 57 5.2 Tài liệu tiếng Anh 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.01 Một số ñặc tính sinh hóa thông thường của P.multocida 9

Bảng 1.02 Hệ thống phân loại Pasteurella multocida 13

Bảng 1.03 Mối liên hệ giữa hai hệ thống ñịnh type P.multocida 14

Bảng 2.01 Thành phần phản ứng IHA 33 Bảng 3.01 Kết quả kiểm ñịnh một số chỉ tiêu giống sản xuất 35

Bảng 3.02 Thành phần môi trường thử nghiệm 38

Bảng 3.03 Ảnh hưởng của môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn 39

Bảng 3.04 Ảnh hưởng của hàm lượng DO ñến ñậm ñộ vi khuẩn 42

Bảng 3.05 Kết quả ñánh giá chất lượng nhũ dầu thử nghiệm 44

Bảng 3.06 Ảnh hưởng của chất bổ trợ ñến chỉ tiêu an toàn và hiệu lực

của văc xin

45

Bảng 3.07 Kết quả theo dõi biểu hiện lâm sàng của gà sau khi ñược

tiêm văc xin nhũ dầu THT

46

Bảng 3.08 Kết quả kiểm nghiệm văc xin (bổ trợ Montanide ISA 70M VG) 48 Bảng 3.09 Kết quả kiểm nghiệm văc xin (bổ trợ Montanide ISA 760 VG) 49 Bảng 3.10 Chỉ số miễn dịch của gà ñối với văc xin 51 Bảng 3.11 ðộ dài miễn dịch của văc xin Tụ huyết trùng nhũ dầu 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.01 Sơ ñồ pha loãng canh khuẩn 30 Hình 2.02 Mô hình phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp 31 Hình 3.01 Biểu ñồ biến ñộng năng suất sinh khối (log CFU/ml) theo

thành phần và nguồn gốc môi trường

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Là một trong hai lĩnh vực trọng yếu của sản xuất nông nghiệp Hiệu quả kinh tế do ngành chăn nuôi mang lại ñã góp phần quan trọng hiện thực hóa chính sách “xóa ñói, giảm nghèo bền vững” do Chính phủ ñề ra, giải quyết công ăn việc làm cho người dân tại các vùng nông thôn, ñảm bảo cung cấp ñủ thực phẩm cho nhu cầu xã hội và tiến tới xuất khẩu Tuy nhiên, mặt trái của sự phát triển ñó là tình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh bùng phát rất khó kiểm soát và thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm do lạm dụng thuốc kháng sinh, hóa dược trong chăn nuôi và công tác phòng chống dịch bệnh ñang từng ngày

ñe dọa sức khỏe người dân

Trong những năm gần ñây, thế giới lên tiếng cảnh báo về tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh và hóa dược trị liệu trong công tác khống chế và kiểm soát dịch bệnh trong chăn nuôi Việc lạm dụng thuốc kháng sinh khá phổ biến trong chăn nuôi tiềm ẩn nhiều nguy cơ như: Tồn dư thuốc kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi, ảnh hưởng ñến sức khỏe người sử dụng, bên cạnh ñó là nguy cơ kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn, gây khó khăn cho công tác phòng chống dịch bệnh trên người và ñộng vật Chính vì vậy, sử dụng các chế phẩm sinh học ñể phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi là hướng ñi tất yếu ñể ñảm bảo có một ngành chăn nuôi an toàn và bền vững

Bệnh tụ huyết trùng gia cầm là bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn tụ huyết trùng

(Pasteurella multocida) gây ra ở tất cả các loài gia cầm: Gà, vịt, ngan, ngỗng và ở các lứa

tuổi ñều có thể mắc bệnh Tỷ lệ chết có thể lên tới 80-90% nếu không can thiệp thuốc kháng sinh kịp thời Tổn thất kinh tế do bệnh tụ huyết trùng gây ra hàng năm ñối với ngành chăn nuôi gia cầm là không nhỏ Cụ thể, theo thống kê của Chi cục thú y các tỉnh cho thấy; năm 2004 chỉ trong tháng 1 ñã ghi nhận số gia cầm chết do tụ huyết trùng tại tỉnh Long An khoảng 100.000 con, tỉnh Tiền giang khoảng 40.000 con (http://vietbao.vn/Xa-hoi/Ga-chet-hang-loat-Co-trieu-chung-cua-benh-tu-huyet-

trung/40014931/157/)

Thống kê hằng năm của các trang trại chăn nuôi gia cầm tập chung cũng cho thấy:

Tỷ lệ gia cầm chết do tụ huyết trùng là không nhỏ, thiệt hại ñáng kể nhất trên ñàn gia cầm

sinh sản Tuy nhiên, việc phòng bệnh bằng văc xin chưa thực sự ñược quan tâm cũng như chưa mang lại hiệu quả tối ưu do nhiều nguyên nhân Trong ñó có các nguyên nhân liên quan ñến chất lượng và hiệu quả sử dụng văc xin Hiện nay, văc xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho gia cầm ñã và ñang ñược một số doanh nghiệp sản xuất ở dạng văc xin bất hoạt với chất bổ trợ keo phèn Tuy nhiên, hiệu lực và ñộ dài miễn dịch chưa cao, với ñối tượng gia cầm sinh sản thường phải tiêm 2-3 ñợt/năm mà hiệu quả bảo hộ vẫn chưa ñược ñảm bảo Như vậy, việc nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật nhằm nâng cao chất lượng văc xin với hai chỉ tiêu quan trọng là hiệu lực và ñộ dài miễn dịch là việc làm cần thiết và cấp bách nhằm kiểm soát dịch bệnh, giảm thiểu việc sử dụng thuốc kháng sinh trong công tác phòng và ñiều trị bệnh tụ huyết trùng gây ra trên gia cầm, ñặc biệt là gia cầm sinh sản Xuất phát từ nhận ñịnh trên chúng tôi tiến hành ñề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu quy trình sản xuất văc xin bất hoạt Tụ huyết trùng gia cầm nhũ dầu quy mô phòng thí nghiệm”

2 Mục ñích nghiên cứu và ý nghĩa của ñề tài

- Lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu cho quy trình sản xuất vắc xin tụ huyết trùng sử dụng

giống gốc P multocida N41

- Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắc xin THT gia cầm dạng nhũ dầu

- Xác ñịnh ñược hiệu quả sử dụng vắc xin tiến tới tạo sản phẩm vắc xin ñảm bảo các yêu cầu, tiêu chuẩn có thể sử dụng phòng tụ huyết trùng gia cầm với hiệu lực và khả năng bảo hộ cao

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

Làm cơ sở xây dựng quy trình công nghệ tối ưu trong sản xuất vắc xin Tụ huyết trùng gia cầm dạng nhũ dầu có chất lượng tốt, hiệu quả phòng bệnh cao, hạ giá thành sản phẩm

1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Tụ huyết trùng

Tụ huyết trùng (THT) là bệnh xảy ra ở hầu hết các nước trên thế giới và ñược nhiều nhà nghiên cứu khẳng ñịnh là có tính chất mùa vụ Bệnh thường xảy ra vào trước và sau mùa mưa lũ, những nơi có khí hậu ẩm ướt, nắng nóng, mưa nhiều Do ñó, bệnh rất phổ biến ở vùng ñông nam châu Á và gây những tổn thất không nhỏ cho ngành chăn nuôi các nước trong khu vực

Bệnh ñược phát hiện và nghiên cứu từ khá lâu, trải qua nhiều giai ñoạn và hiện nay vẫn là chủ ñề quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Theo Phan Thanh Phượng (1989), có thể tóm tắt những nghiên cứu bước ñầu về bệnh THT như sau:

Năm 1878, Bollinger là người ñầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng xảy ra trên

bò tại ðức

Năm 1879, Tousain phát hiện bệnh tụ huyết trùng xảy ra trên gà

Năm 1880, Luis Pasteur nhà vi trùng học người Pháp ñã phát hiện ra vi khuẩn gây

bệnh tụ huyết trùng gà (Powl cholera)

Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và ñặt tên là bệnh bại huyết (Septicaemia

disease)

Năm 1886, Loeffer phát hiện ra bệnh xảy ra trên lợn Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý người ðức phát hiện thấy sự tương ñồng về triệu chứng, bệnh tích ở bò, gà và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng

Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh và ñặt tên là Barbone Trevissan ñã

ñề nghị ñặt tên chung cho giống vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella ñể tưởng nhớ ñến nhà bác học Louis Pastuer, người ñầu tiên phát hiện vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà Từ ñó người ta căn cứ vào ñặc tính sinh bệnh cụ thể của từng loài vật, chia

Pasteurella thành các loài khác nhau:

Pasteurella gây bệnh cho bò là P.boviseptica

Pasteurella gây bệnh cho trâu là P.bubaliseptica

Pasteurella gây bệnh cho lợn là P.suiseptica

Pasteurella gây bệnh cho gia cầm là P.aviseptica

Năm 1939, Rosenbusch và Merchant ñã ñề nghị ñặt tên chung cho vi khuẩn gây

bệnh tụ huyết trùng là P.multocida ñể thể hiện khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của

vi khuẩn này

Tại Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng và vi khuẩn tụ huyết trùng cũng ñã và ñang là mối quan tâm của rất nhiều nhà khoa học Trong ñó, có thể kể ñến những công trình nghiên nghiên cứu tiêu biểu như:

Phan Thanh Phượng và cộng sự, 1993 nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý ở gia súc, gia cầm ñược tiêm văc xin tụ huyết trùng có các chất bổ trợ khác nhau ñã khẳng ñịnh rằng các chỉ tiêu sinh lý có biến ñộng nằm trong giới hạn sinh lý bình thường

Nguyễn Ngã, 1995 nghiên cứu tính kháng nguyên và ñộc lực vi trùng gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò khu vực miền trung, nhằm chọn giống vi khuẩn ñịa phương thích hợp có khả năng phối hợp với giống nước ngoài ñể chế tạo văc xin ñạt hiệu lực cao Kết

quả là vi khuẩn P.multocida chủng TS ñịa phương cho khả năng bảo hộ cao và ổn ñịnh

hơn cả

Hoàng ðạo Phấn, 1996 nghiên cứu tác ñộng của thực khuẩn thể ñặc hiệu ñối với

P.multocida phân lập từ gia súc, gia cầm Kết quả cho thấy: 84,2% trong số 76 chủng vi khuẩn bị dung giải bởi các thực khuẩn thể ñặc hiệu

Nguyễn Thiên Thu và Nguyễn Ngã, 1996 phân lập và xác ñịnh type huyết thanh

P.multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam Kết quả, trong số 469 mẫu bệnh phẩm (dịch ngoáy mũi) có 21 bệnh phẩm ñược xác ñịnh có vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng, bằng phản ứng IHA xác ñịnh ñược 18/21 mẫu thuộc type B Carter - type gây bệnh

tụ huyết trùng có thể thấy ở hạch lympho, niêm mạc ñường hô hấp trên của trâu bò với hiệu giá ngưng kết 1/64

Trương Văn Dung, 1998 nghiên cứu ñặc tính và ñịnh type huyết thanh học vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò phân lập ñược ở một số tỉnh phía bắc Kết quả là trong 92 chủng có 14 chủng thuộc type A, 23 chủng thuộc type B, 30 chủng thuộc liên type A, B,

ðinh Duy Kháng và Lê Văn Phan, 2000 ñã ứng dụng kỹ thuật PCR ñể ñịnh type vi

khuẩn P.multocida phân lập ở miền trung Việt Nam HB1, HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi ñược dùng ñể xác ñịnh P.multocida type B gây bại huyết, xuất huyết Trong số 7

chủng chuẩn Quốc gia (I2, IR, 41, 43, 99, 483, 8936) thì chỉ có chủng IR có hình ảnh ñặc

chưng của type B TOX1, TOX2 là cặp mồi dùng ñể xác ñịnh P.multocida type A và D

có gen ñộc tố (toxin) A ñã xác ñịnh chủng 99 có mang gen ñộc tố này

Cao Văn Hồng, 2002 nghiên cứu về mùa dịch và ảnh hưởng của các yếu tố khí hậu ñến bệnh tụ huyết trùng gia súc ở ðắc Lắc Kết quả cho thấy, thời tiết có tác ñộng ñến bệnh tụ huyết trùng gia súc, ảnh hưởng của lượng mưa ñến số lượng gia súc ốm do tụ huyết trùng là rõ rệt nhất

Trương Văn Dung, Hoàng Xuân Nghinh và cộng sự, 2000 xác ñịnh type huyết thanh học vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò:

Type B gây bại huyết (Heamorhagic Septicaemia)

Tye A, D gây viêm phổi bê, nghé (Bovine Pneumonic Pasteurellosis)

Type D và Bordetella bronchiseptica gây viêm teo mũi truyền nhiễm

1.2 Tình hình nghiên cứu văc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam

Phan Thanh phượng và cộng sự nghiên cứu chế tạo văc xin nhũ hóa Tụ huyết trùng trâu bò có hiệu lực miễn dịch cao nhằm thay thế văc xin keo phèn có hiệu lực miễn dịch thấp (Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1979-1984)

Nguyễn Ngã, Lê Minh Tâm và Nguyễn Bá Cường nghiên cứu sản xuất văc xin tụ huyết trùng trâu bò chủng Iran (Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1985-1989) Phan Thanh Phượng và cộng sự nghiên cứu văc xin nhũ hóa tụ huyết trùng trâu bò trong sản xuất Kết quả, sản xuất kháng nguyên trong bình lên men sục khí, tạo nhũ trong máy gây nhũ, bảo quản văc xin trong ñiều kiện nhiệt ñộ 4-100C, hiệu lực văc xin ñạt 100% trong 12 tháng (công trình nghiên cứu KHKT thú y 1990-1991)

Văc xin phòng bênh tụ huyết trùng cho gia súc gia cầm có 3 loại: Văc xin vô hoạt

không có chất bổ trợ (Bacterin), văc xin vô hoạt có chất bổ trợ và văc xin tái tổ hợp Văc xin vô hoạt không có chất bổ trợ (Bacterin): Vi khuẩn cường ñộc ñược bất hoạt

bằng Formalin với nồng ñộ 0,3%, ñộ dài miễn dịch ngắn và gây phản ứng mạnh nên hiện nay không còn ñược sử dụng

Văc xin vô hoạt có chất bổ trợ: Vi khuẩn ñược bất hoạt bằng Formalin 0,3%, phối hợp với các chất bổ trợ phù hợp Văc xin lại này thường có ñộ an toàn cao, ñộ dài miễn dịch cao hơn văc xin không có bổ trợ

Văc xin tái tổ hợp, là thế hệ văc xin phòng bệnh tiên tiến nhờ áp dụng những thành tựu trong công nghệ sinh học phân tử Sự tiến bộ của khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tử hiện nay cho phép chúng ta nghĩ ñến và hy vọng tới việc chế tạo ra các loại văc xin tổng hợp ñể phòng chống các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho người và vật nuôi trong tương lai

1.3 Vi khuẩn P.multocida

1.3.1 ðặc tính sinh học

Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Parvobacteriaceae, giống Pasteurella và chia làm 3 loài, trong ñó loài gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là P.multocida và P.heamolytica

ðặc ñiểm hình thái

P.multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thước 0,25-0,4 x 0,4-1,5 µm Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di ñộng

Tính chất bắt màu của vi khuẩn

P.multocida bắt màu gram âm với thuốc nhuộm gram

Khi phân lập từ cơ thể gia súc mắc bệnh (máu, phủ tạng…) và trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn khi ñược nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai ñầu còn ở giữa

không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai ñầu, nên người ta còn gọi P.multocida là

vi khuẩn lưỡng cực ðiều này ñược Manninger, 1919 giải thích là do tế bào vi khuẩn ñang trong giai ñoạn phân chia, vi khuẩn tăng lên về kích thước, ñộc lực và nguyên sinh chất Khi ñó, nguyên sinh chất dung giải và dồn về hai ñầu của vi khuẩn

Trong canh khuẩn non thường thấy vi khuẩn có hình trứng, hình cầu ñứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già vi khuẩn bị suy

yếu, biến dạng, thay ñổi hình thái như hình gậy dài, dùi cui, quả ñấm, kích thước lớn hơn bình thường, có khi dài 2-3 µm hoặc dài hơn

1.3.2 ðặc tính nuôi cấy của P.multocida

P.multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí không bắt buộc, có thể nuôi ở nhiệt ñộ 15-380C (thích hợp nhất ở 370C), pH 7,2-7,4 Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, trong môi trường có thêm huyết thanh hoặc máu thì vi khuẩn phát triển tốt

* Trong môi trường nước thịt:

Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C canh khuẩn ñục, lắc có hiện tượng vẩn như sương mù rồi mất, ñáy ống nghiệm có cặn nhầy Môi trường có mùi tanh ñặc trưng Theo Carter, 1995, mùi tanh ñặc trưng nhất ở pha vi khuẩn phát triển nhanh Trong môi trường nước thịt vi

khuẩn P.multocida phát triển theo 4 pha lần lượt: Pha chậm, pha nhanh, pha cân bằng và

pha suy thoái, ñể lâu thì mùi tanh giảm dần

* Trên môi trường thạch thường

Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, trong suốt như hạt sương, mặt khuẩn lạc vồng Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường

Trên môi trường thạch thường vi khuẩn P.multocida có thể phát triển thành những

* Trên môi trường thạch máu:

Vi khuẩn phát triển tốt hơn, khuẩn lạc to hơn trên thạch thường, không gây dung huyết Môi trường này thường ñược dùng ñể giữ giống vi khuẩn

* Trên môi trường thạch huyết thanh:

ðây là môi trường ñể phân lập, giám ñịnh và xác ñịnh ñộc lực của vi khuẩn

P.multocida Trên môi trường này vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc ñặc biệt, có hiện tượng dung quang khi quan sát khuẩn lạc dưới kính hiển vi có ñộ phóng ñại thấp (20x) với góc chiếu tới 450 của ánh sáng ñèn

Tùy theo ñộc lực của vi khuẩn mà màu sắc dung quang của khuẩn lạc khác nhau: Nếu vi khuẩn có ñộc lực cao thì khuẩn lạc quan sát ñược có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm khoảng 2/3 diện tích khuẩn lạc, 1/3 diện tích còn lại của khuẩn lạc là màu vàng và

vàng cam Khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent)

Nếu vi khuẩn có ñộc lực vừa, khuẩn lạc quan sát thấy màu xanh lơ ít hơn màu vàng

da cam Khuẩn lạc này gọi là Fo (Orange Fluorescent)

Nếu vi khuẩn có ñộc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng dung quang,

không màu và ñược gọi là Nf (Not Fluorescent) Khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong suốt

Hiện tượng dung quang của khuẩn lạc Tụ huyết trùng thể hiện rõ khi nuôi cấy vi khuẩn 16-18 giờ ở 370C Nếu nuôi cấy quá giờ trên, hiện tượng dung quang sẽ giảm dần

và mất ñi

Theo Smith, ñặc tính dung quang có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của P.multocida

Dựa vào ñặc tính này người ta có thể chọn lọc ñược những chủng vi khuẩn gây bệnh Tụ huyết trùng có tính kháng nguyên cao và khả năng gây ñáp ứng miễn dịch tốt

1.3.3 ðặc tính sinh hóa của P.multocida

Cũng như các loại vi khuẩn khác, P.multocida khi ñược nuôi cấy trong các môi

trường dinh dưỡng, quá trình trao ñổi chất diễn ra trong tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay ñổi pH của môi trường Khi ñó, dựa vào sự thay ñổi màu sắc của các chất chỉ thị màu trong môi trường người ta có thể xác ñịnh ñược ñặc tính sinh hóa của

chúng Trên bảng 1.01 là một số ñặc tính sinh hóa ñiển hình của P.mutocida

Bảng 1.01 Một số ñặc tính sinh hóa thông thường của P.multocida

Theo Carter, 1984 vi khuẩn P.multocida có một số ñặc tính sinh hóa sau:

- Dương tính trong phản ứng Oxydase và Catalase

- Âm tính khi kiểm tra khả năng dung huyết, khả năng di ñộng và khả năng làm tan chảy Gelatin và khả năng mọc trên môi trường MacConkey

- Lên men không sinh hơi các loại ñường: Glucose, saccarose, manitonse, sorbit và xylone

- Không lên men các loại ñường: Lactose, maltone, ramose, salixin, dunxid và adonit

1.3.4 Giáp mô của vi khuẩn P.multocida

P.multocida là loại vi khuẩn có khả năng sinh giáp mô, là yếu tố ñộc lực quan trọng của vi khuẩn Giáp mô ñược sinh ra ở những ñiều kiện nhất ñịnh trong quá trình sinh trưởng Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác ñộng có hại

từ môi trường Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn

Theo Manniger, 1919 vi khuẩn có giáp mô thường có ñộc lực cao, nhưng ñộc lực của vi khuẩn lại phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng Theo Carter, 1967 vi khuẩn phân lập từ ñộng vật mắc bênh cấp tính ña số ñều thấy

Theo Harmon, 1991 axit Hyaluronic không gây hoạt hóa kháng thực bào, nhưng

chất chiết giáp mô có khả năng ức chế khả năng thực bào của bạch cầu ña nhân trong

máu bò Nếu tách axit Hyaluronic khỏi giáp mô sẽ làm tăng khả năng bám dính của vi

khuẩn lên bề mặt của tế bào ñộng vật ký sinh, tăng tính mẫn cảm của vi khuẩn ñối với sự thực bào

Theo Wilson, 1992 tính kháng nguyên giáp mô của vi khuẩn P.multocida xác ñịnh

theo type huyết thanh A, B, D, E, F

Bain và De Alwis, 1982 nhận thấy có thể phân lập ñược cả vi khuẩn có giáp mô và không có giáp mô từ cơ thể ñộng vật mắc bệnh Tụ huyết trùng Nuôi cấy vi khuẩn ở 370C với môi trường cơ bản có chứa 0,05% Glucose thì giáp mô phát triển tốt Ngược lại, nếu môi trường chứa nhiều Glucose và ở 280C thì giáp mô không hình thành

Theo Eslinger và cộng sự, 1992 các chủng P.multocida Serotype A ñều có tính bám

dính mạnh ñối với tế bào Hela, trong khi ñó Serotype B, D, E có ñộ bám dính thấp hơn nhiều

ðể quan sát giáp mô người ta nhuộm vi khuẩn bằng mực Ấn ðộ, hoặc dùng dung

quang khuẩn lạc

Theo Rimler, 1992 nếu khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng thì vi khuẩn có giáp

mô

1.3.5 ðộc tố của vi khuẩn P.multocida

Theo Sawuata, 1984 một số chủng P.multocida thuộc serotype D có khả năng sinh

ra một yếu tố ñược gọi là yếu tố sinh hoại tử da (Dermo Necroti Toxin – DNT), có bản

chất là protein Tác ñộng của DNT là gây hoại tử biểu bì, gây ñộc với tế bào phổi bò, gây chết và ỉa chảy nhầy, teo lách ở chuột

Theo Rimeler, 1989 và Brogden, 1980-1982: Trong chất lọc canh trùng già có một

loại ñộc tố có bản chất lipo-polysaccarit (LPS) Khi tiêm chất này vào tĩnh mạch trâu bò

sẽ gây phản ứng sốt, ỉa chảy ra máu và có thể tử vong

1.3.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida rất phức tạp và chưa ñược biết ñầy

ñủ Cho ñến nay người ta ñã xác ñịnh ñược P.multocida có hai loại kháng nguyên: Kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên thân (O)

Kháng nguyên vỏ (K – Kapsular antigen)

Kháng nguyên K có bản chất là polysaccharide, là một bán kháng nguyên Kháng nguyên K chỉ có ở những chủng ñộc hay những chủng P.multocida tạo khuẩn lạc dạng S

Kháng nguyên K nhận ñược bằng cách cho canh khuẩn non vào nước cất ñun sôi cách thủy trong 1 giờ, ly tâm lấy phần dịch trong, bỏ cặn

Kháng nguyên K có hai thành phần: α và β, ñược cấu tạo từ protein và

polysaccharide, có khả năng gắn lên thụ thể của tế bào hồng cầu Người ta dùng kháng nguyên này ñể ñịnh type kháng nguyên giáp mô bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián

tiếp (IHA: Indirect Haemagglutination Assay)

Các protein trên màng gọi là OMPs (Outer Membrance Proteins) ñược coi là chất

chỉ thị ñể ñánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch trong rất nhiều phản ứng miễn

dịch Theo Muniady và Murata (1993) tính sinh miễn dịch của một số lipopolysaccharide

chính là do thành phần OMPs của màng tế bào vi khuẩn

Kháng nguyên thân (O – Somatic antigen)

Kháng nguyên O có bản chất là gluxit-lipit-protein, ñộc với chuột nhắt và gây ñược miễn dịch Lớp kháng nguyên thân (O) bị kháng nguyên K che phủ, khỏi bị thực bào tác ñộng ðồng thời, kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O Do ñó, muốn phát hiện kháng nguyên O phải phá hủy ñược kháng nguyên K Kháng nguyên O gồm hai nhóm: ðặc hiệu và không ñặc hiệu Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O Chỉ có serotype B hầu như ñồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O

Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại:

- Theo Namioka và Murata, 1961 kháng nguyên O có 12 yếu tố

- Theo Heddleston, 1972 kháng nguyên O có 16 yếu tố, ký hiệu từ O1 ñến O16

Kháng nguyên O là kháng nguyên thành tế bào vi khuẩn P.multocida Theo Namioka và Murata: Khi khuẩn lạc của vi khuẩn P.multocida chuyển từ dạng S sang

dạng R thì vi khuẩn vẫn giữ ñược kháng nguyên O

Kháng nguyên O của vi khuẩn P.multocida là một phức hợp

protein-lipopolysaccharide, ñược chiết xuất nhờ axit trichloacetic, dung dịch phenol và máy siêu

âm

Trong phản ứng huyết thanh học kháng nguyên O có ñặc tính loài rất cao Tuy nhiên,

nó cũng tạo ra phản ứng chéo với các mẫu huyết thanh kháng các vi khuẩn gram âm khác

như P.pseudotuberculin, P.heamolytica

Hiện nay, trong khi nghiên cứu chế văc xin phòng bênh tụ huyết trùng cho gia súc, gia cầm, một số tác giả ñã tiến hành tách kháng nguyên O và kháng nguyên K riêng ra

với mục ñích là ñể bộc lộ kháng nguyên O, tạo miễn dịch tốt hơn P.multocida có tính

kháng nguyên giao hỗ (tương ñồng kháng nguyên), tạo miễn dịch chéo giữa các chủng Tính chất này thể hiện nhiều hay ít phụ thuộc vào từng chủng

Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng nguyên của

P.multocida rất quan trọng trong việc chế tạo văc xin ñặc hiệu Một văc xin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên tương ứng với các serotype của các chủng phân lập ñược

Các type huyết thanh học của vi khuẩn P.mutocida:

Theo quy ñịnh của FAO, ñể xác ñịnh serotype của vi khuẩn P.multocida cần kết hợp

cả hai hệ thống ñịnh type kháng nguyên là ñịnh type kháng nguyên vỏ (K) và ñịnh type kháng nguyên thân (O)

Cho ñến nay, các type huyết thanh học của P.multocida ñược mô tả dựa theo hai hệ

thống phân loại chính của Rober, 1947 và Carter, 1952

Theo Rober, 1947 P.multocida gồm 4 type là I, II, III, IV, sau này Hudson, 1954 tìm

Năm 1963, Carter phát hiện thấy type C không tồn tại và quyết ñịnh xóa bỏ danh pháp của type này

Carter và Chengapa, 1981 cho rằng: Cần kết hợp hai phản ứng là phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu và phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch ñể xác ñịnh serotype

của vi khuẩn P.multocida

Năm 1987, Rimler và Rhoader bằng phản ứng IHA ñã bổ sung thêm một type mới gây bệnh cho gà tây, gọi là type F

Bảng 1.02 Hệ thống phân loại P.multocida

Phân loại theo kháng nguyên K

Carter (1955) IHA Type A, B, C,

D Carter (1961) IHA Type E

Carter (1963) IHA Bỏ type C Rimler và Rhoader (1987) IHA Type F

Namioka và Murata (1961) NK tế bào đã xử lý HCl Type 1 - 12 Namioka và Bruner (1963) AGPT Type 1 - 16 Namioka và Murata (1964) AGPT Type 1 - 16 Heddleston (1996) AGPT Type 1 - 16

Chú thích: AGPT (Agar Gel Precipitation Test): Phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch; IHA (Indirect Heamagglutination Assay): Phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu; NK: Phản ứng ngưng kết

Nhìn chung, cĩ hai hệ thống định type của P.multocida được dùng phổ biến là:

[Namioka, 1961 – Carter, 1955] và [Carter, 1955 – Heddleston, 1972]

Nhiều thực nghiệm sau này đã chứng minh được mối liên hệ giữa hai hệ thống định type của Robert và Carter như sau:

Bảng 1.03 Mối liên hệ giữa hai hệ thống định type P.multocida

Type A Tương đương Type II, III, IV Type B Tương đương Type I

Type D Tương đương Type IV

Type E, F Khơng tương đương

Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử là phương pháp chẩn đốn cho kết quả nhanh nhất và chính xác nhất mà thế giới và Việt Nam đang áp dụng để định type vi khuẩn

P.multocida ð inh Duy Kháng và cs, ( 2000), ðỗ Ngọc Thúy và cs, (2007) đã ứng dụng

kỹ thuật PCR để định type vi khuẩn P.multocida phân lập ở Việt Nam

1.4 Bệnh tụ huyết trùng gia cầm

1.4.1 Dịch tễ học

Ở Việt Nam, bệnh Tụ huyết trùng thường bắt đầu xảy ra vào tháng 3-4, phát mạnh vào tháng 5-7 và lui dần vào tháng 8-9, xuất hiện lại vào tháng 10-11 Hầu hết các lồi gai gia súc, gia cầm đều mắc bệnh (Nguyễn Xuân Bình, 1995)

Hiện nay, bệnh xảy ra hầu như quanh năm, mạnh nhất vào mùa mưa Hầu hết các loại gia cầm đều mắc

1.4.3 ðường xâm nhập và phương thức truyền bệnh

Hugher, 1930 thấy rằng khi cho gà uống canh trùng P.multocida bọc gelatin gà

không mắc bệnh, nhưng khi nhỏ mũi gà lại mắc bệnh

Theo Pritchett và Hugher, 1932 P.multocida thường xâm nhập vào cơ thể gia cầm

qua niêm mạc hầu, họng, ñường hô hấp, vết thương trên da Arson dùng canh trùng ñánh dấu ñồng vị phóng xạ P.32 thấy rằng: ðường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn là qua niêm mạc miệng và họng

Prichett kiểm tra trên ñàn gà Leghorn thương phẩm cho biết có rất nhiều gà mang vi

khuẩn P.multocida trong vòm mũi, ñây là nguồn lây bệnh cho toàn ñàn

Các tác giả Vanes, Olney, Hall ñã chứng minh rằng những con sống sót sau một vụ dịch có thể chính là ổ chứa mầm bệnh Tác giả nghiên cứu 200 phôi gà từ gà mái nhiễm

bệnh cho thấy P.multocida không lây truyền qua trứng Iliew, 1963 cho thấy, những chủng P.multocida phân lập từ trâu bò, lợn không gây bệnh cho gia cầm, nhưng 18 chủng

phân lập ñược từ vùng thường xuyên có bệnh thấy khả năng gây bệnh cho gia cầm rất cao Bao bì ñựng thức ăn và dụng cụ chăn nuôi có thể là nhân tố trung gian truyền bệnh

1.4.4 Lứa tuổi mắc và tỷ lệ tử vong

Hugher, 1930 tiến hành theo dõi trên ñàn gà 90.000 con thấy rằng, tỷ lệ tử vong của

gà trên 4 tháng tuổi cao hơn ở gà dưới 4 tháng tuổi Tác giả cũng thấy rằng gà tây là loài mẫn cảm nhất, tỷ lệ tử vong có thể lên ñến 90-100% Gà trưởng thành sau 48 giờ gây bệnh với chủng vi khuẩn cường ñộc bằng cách phiết bông tẩm mầm bệnh vào khe mũi hoặc cho tiếp xúc trực tiếp với gà bệnh thì hầu hết gà dò ñều mắc bệnh Tỷ lệ tử vong là

35-45% ở ñàn gà trong 4 tuần sau khi nhốt chung với gà bệnh

1.4.5 ðộng vật cảm thụ

Gà, chim và các loại thủy cầm ñều mẫn cảm với bệnh Ngoài ra, khi gây bệnh thực

nghiệm với chủng P.multocida phân lập ñược từ gia cầm mắc bệnh qua ñường mũi

Heddleston và Watko, 1964 nhận thấy chúng gây chết thỏ, bồ câu và chim sẻ nhưng không thấy biểu hiện lâm sàng nào khi gây bệnh cho chuột cống, chuột lang, cừu, lợn và

bò

1.4.6 Nguồn bệnh và phương thức lây truyền bệnh

Hughes, 1930 khi nghiên cứu trên ñà gà Leghor thương phẩm cho thấy rất nhiều gà

mang mầm bệnh P.multocida trong khe mũi Các tác giả còn cho thấy rằng gà mang vi

khuẩn chính là nguồn gây bệnh cho toàn ñàn Công trình nghiên cứu của Hala, 1955 cho thấy rằng những gà sống sót trong ổ dịch có thể chính là ổ chứa mầm bệnh và các tác giả

cũng chứng minh P.multocida có thể ñược truyền qua trứng sau khi nghiên cứu 2000

phôi gà từ gà mái mắc nhiễm bệnh Ngoài ra, chim hoang giã cũng là nguồn gây bệnh cho gia cầm

Hầu hết các loài gia súc ñều là vật mang trùng ñối với P.multocida Tuy nhiên, phần lớn các chủng P.multocida này không có khả năng gây bệnh cho gia cầm

Rimler và cộng sự, 1989 ñã phân lập ñược P.multocida từ hạch amidan bò, cừu, lợn

thì các chủng phân lập ñược từ bò và cừu không gây bệnh cho gia cầm, nhưng 18 chủng phân lập ñược từ lợn ở vùng có bệnh thường xuyên có khả năng gây bệnh cho gia cầm cao và chỉ có 2/47 chủng ở lợn trong vùng ít có bệnh là có ñộc lực ñối với gia cầm

1.4.7 Các loại kháng nguyên P.multocida

ðể chế tạo ñược văc xin có hiệu lực phòng bệnh cao thì việc nghiên cứu ñể hiểu rõ

về kháng nguyên, sự phân bố và vai trò của chúng ñối với khả năng kích thích sinh ñáp ứng miễn dịch là vô cùng quan trọng

Ngày nay, vai trò của kháng nguyên P.mutocida trong ñáp ứng miễn dịch ñã dần

ñược làm sáng tỏ ðối với P.multocida gây bệnh cho gia cầm và vai trò của các loại kháng nguyên ñược nghiên cứu khá sâu, song vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau của các tác

giả ñối với vai trò của từng loại kháng nguyên khác nhau Bằng công nghệ sinh học phân

tử, ngày ngay vai trò của từng loại kháng nguyên ñối với khả năng kích thích sinh ñáp ứng miến dịch của cơ thể ñang dần ñược xác ñịnh

Polysaccharide tinh khiết

Theo Confer, 1993 bản chất capsule của P.multocida là polysaccharide và nó giữ vai

trò kích thích sinh ñáp ứng miễn dịch

Theo Avakian và cộng sự, 1989 cho rằng kháng nguyên capsule tinh khiết type A kích thích tạo kháng thể ở gia cầm chống lại bệnh sau khi thử thách với kháng nguyên ñồng type

Mosier, 1992 cho rằng, sở dĩ có nhiều ý kiến khác nhau về mức ñộ bảo hộ mà kháng nguyên capsule tinh khiết mang lại là do mức ñộ tinh khiết trong quá trình chiết tách kháng nguyên Kháng nguyên capsule có ñộ tinh khiết cao khó tạo ñáp ứng miễn dịch hơn capsule không tinh khiết do ở capsule không tinh khiết còn chứa nhiều loại protein và các chất có vai trò kích thích tạo kháng thể

Gần ñây, bằng kỹ thuật tinh chế protein có ñộ tinh khiết cao cho phép nhiều tác giả nghiên cứu vai trò của protein tinh khiết trong ñáp ứng miễn dịch ñối với kháng nguyên

của P.multocida trong cơ thể gia súc, gia cầm

Truscott và Hirsh, 1990 ñã tinh chế protein màng ngoài 50Kda từ P.multocida phân

lập ở chim và nhận thấy protein này ức chế khả năng tạo ñáp ứng miễn dịch thực bào ở chim Protein 34 Kda cho phản ứng dương tính với huyết thanh của gà kháng

P.multocida cùng serotype Sự khác nhau giữa các protein màng ngoài của các chủng

trong cùng serotype P.multocida phân lập ñược từ gia cầm là ở vị trí gắn của một protein

ở vùng 34 và 38 Kda

Ramdani và Adler, 1992 bằng kỹ thuật kháng thể ñơn dòng và enzyme thực hiện với các kháng nguyên protein tinh chế ñã ñi ñến kết luận, kháng nguyên protein tinh chế chỉ ñóng một vai trò rất nhỏ trong ñáp ứng miến dịch chống Pasteurella mutocida

Lipopolysacharide (LPS)

Theo Rimler và Phillip, 1986 LPS là một kháng nguyên, song mức ñộ ñáp ứng miễn

dịch phụ thuộc vào bản chất của loại LPS và loài ñộng vật ñược tiêm Rimler và Rhoades,

1989 cho rằng LPS tinh khiết của P.multocida là chất gây miễn dịch chính ở gia cầm

Tsuji và Matsumoto, 1988 nghiên cứu trên gà tây nhận thấy chất gây miễn dịch chính là phức hợp protein – lipopolisacharide

Mendes và cộng sự, 1994 ñã gây bệnh thực nghiệm bằng cách tiêm LPS có ñộ tinh khiết cao trên gia cầm bằng ñường tiêm dưới da và tĩnh mạch Tác giả nhận thấy, LPS không gây tổn thương ñại thể nhưng gây tổn thương vi thể ở da Tác giả cũng cho rằng LPS tinh khiết ñóng vai trò ñầu tiên trong ñáp ứng viêm ở bệnh tụ huyết trùng gia cầm

Protein ñộc tố

Kết quả nghiên cứu của Rimler và Brogden, 1986, Rimler và Rhoades, 1989 cho

thấy, một số chủng P.multocida serotype A, D có protein ñộc tố (khoảng 145Kda) gây

ñộc cho tế bào phổi bê và gây xuất huyết, hoại tử khi tiêm vào da chuột lang, gây chết ñối với gia cầm và các loài gặm nhấm Thurston và cộng sự cho rằng protein ñộc tố là một kháng nguyên, tác giả ñã thử nghiệm vô hoạt protein ñộc tố (giải ñộc tố) rồi tiêm cho

chuột, chuột ñược miễn dịch khi thử thách với Pasteurela multocida

Cho tới nay nhiều nhà khoa học ñã xác ñịnh kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida

gồm 3 loại:

Kháng nguyên vỏ K (Capsule), bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Carter

ñã phân loại P.multocida gồm 4 serotype A, B, D, E Trong ñó, serotype gây bệnh cho gia cầm là serotype A, D

Kháng nguyên thân O: Khi kháng nguyên vỏ (K) ñược tách ra, vi khuẩn bộc lộ một lớp kháng nguyên thân, ñược phát hiện nhờ phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng

kết tủa khuyếch tán trong thạch Heddleston, 1972 chia P.multocida thành 16 type Trong

ñó chủng gây bệnh cho gia cầm thuộc các type 3,5,7,8 và 9

Sự kết hợp phân loại theo kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên thân (O) cho thấy chủng gây bệnh cho gia cầm thuộc các serotype A9, A3, A7, A8 và D2

Các protein màng ngoài: Pasteur và cộng sự, 1880 ñã triết tách thành công 5 loại

protein màng ngoài của vi khuẩn P.multocida thuộc serotype A3 phân lập từ thỏ và cho

thử thách với chủng vi khuẩn cùng type (theo Phan Thanh Phượng, 1993)

Trong công tác nghiên cứu, chế tạo văc xin, ngoài việc nghiên cứu về cấu trúc và bản chất của từng loại kháng nguyên các nhà khoa học còn quan tâm nghiên cứu cơ chế ựáp ứng miễn dịch, và sự hình thành ựáp ứng miễn dịch ựối với những loại kháng nguyên ựó

Từ ựó xác ựịnh ựược ựường ựưa văc xin vào cơ thể cho phù hợp đối với bệnh tụ huyết trùng gia cầm chúng tôi quan tâm ựến ựáp ứng miễn dịch dịch thể và ựáp ứng miến dịch qua trung gian tế bào

1.4.8 đáp ứng miễn dịch trong bệnh Tụ huyết trùng gia cầm

đáp ứng miễn dịch dịch thể

Miễn dịch dịch thể do các tế bào lympho B ựảm nhận Khi ựược tiếp xúc với kháng nguyên, tế bào lympho B sẽ biệt hóa thành dạng non, sau ựó thành các tương bào (Plastmocyte) có khả năng tiết ra kháng thể lưu ựộng trong máu gồm: IgA, IgG, IgM, IgD

và IgE, tham gia vào các phản ứng miễn dịch

đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Miễn dịch trung gian tế bào do các tế bào lympho T ựảm nhận Khi tiếp xúc với kháng nguyên, lympho T sẽ biệt hóa thành dạng non, sinh sản và trở thành các tế bào mẫn cảm, giải phóng những yếu tố miễn dịch hòa tan (Lympho-kin) với những hoạt tắnh sinh học khác nhau như: Tác ựộng lên ựại thực bào, các bạch cầu ựa nhân, ức chế phân chia tế bào, hoạt hóa chuyển dạng Lympho bào, ựộc Lympho

Dựa trên chức năng, các nhà khoa học phân chia các Lympho T thành 3 nhóm chắnh:

* Nhóm 1: Gồm các tế bào nhớ miễn dịch (Immunomemory cell) còn gọi là những

tế bào mẫn cảm lần ựầu hay những tế bào mẫn cảm kháng nguyên sơ cấp

* Nhóm 2: Gồm các tế bào có khả năng giúp ựỡ, hợp tác với Lympho B trong quá trình tổng hợp kháng thể (gọi là nhóm tế bào giúp ựỡ Helper cell) Các tế bào này có khả năng ức chế hoặc thức ựẩy hoạt ựộng tiết kháng thể của tế bào Lypho B (chức năng ựiều tiết kháng thể)

* Nhóm 3: gồm những tế bào có chức năng chắnh trong ựáp ứng miễn dịch tế bào còn gọi là các tế bào effector, chúng là những tế bào mẫn cảm kháng nguyên, có khả năng

nhận biết kháng nguyên nhờ các thụ quan có trên bề mặt của chúng, chính các tế bào này giải phóng ra chất trung gian gọi là các yếu tố miễn dịch hòa tan (lympho-kin), là nguồn gốc biểu hiện của phản ứng miễn dịch tế bào

ðại thực bào vừa có vai trò trong miễn dịch dịch thể, vừa có chức năng trong miễn dịch tế bào Vai trò của ñại thực bào là bắt, nuốt và tiêu kháng nguyên thành nhiều mảnh nhỏ và thành siêu kháng nguyên và làm tăng tính kháng nguyên, thông tin cho các tế bào

có thẩm quền miễn dịch ñể tiết kháng thể Trong miễn dịch tế bào, ñại thực bào ñóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo quá mẫn muộn

ðến nay, vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau về tầm quan trọng của miễn dịch dịch thể

và miễn dịch tế bào trong bệnh Tụ huyết trùng gia cầm Trong ñó, nhiều nhà nghiên cứu

ñã xác nhận vai trò của miễn dịch dịch thể như Heddleston, 1966; Bolotnicow, 1972; Bain và cộng sự, 1982; Tsuji và cộng sự, 1988; Avakian, 1986 Các tác giả ñều cho rằng

có sự ñồng biến giữa hàm lượng kháng thể lưu ñộng trong máu và mức ñộ miễn dịch chống bệnh của ñộng vật Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu khác cho rằng miễn dịch dịch thể không quan trọng bằng miễn dich tế bào trong việc bảo vệ cơ thể chống

P.multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho gia cầm Baba (1984) cho rằng, ñáp ứng miễn dịch chống bệnh Tụ huyết trùng gia cầm chủ yếu do tế bào ñại thực bào và Lympho T ñảm nhiệm Theo công bố của MBL-USA-Japan (1996) bằng phản ứng ELISA ñã chứng minh ñược hàm lượng kháng thể không nhất thiết phải tương quan với khả năng bảo vệ cơ thể, chống lại sự nhiễm khuẩn, hàm lượng kháng thể thấp không có nghĩa là khả năng chống bệnh kém

Những nghiên cứu của Trusscott và cộng sự, 1990; Ramdani và Adler, 1991 ñều

nhận thấy P.multocida có thể tồn tại sống trong các tế bào ñại thực bào của gia cầm, sự ñề kháng của P.multocida có ñược là nhờ các protein ñộc tố ở màng ngoài của vi khuẩn

1.5 Văc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng gia cầm

1.5.1 Quá trình phát triển văc xin phòng Tụ huyết trùng

Bệnh tụ huyết trùng gia cầm thường xảy ra ở thể cấp tính, tỷ lệ chết cao Vì vậy, việc

sử dụng văc xin phòng bệnh là việc làm cần thiết

ông ñã tiến hành làm giảm ñộc lực của mầm bệnh và dùng chúng làm văc xin nhược ñộc

ñể phòng bệnh cho gà

Heddleston, 1972 và Bairey, 1975 ñã nghiên cứu chế tạo văc xin chết Loại văc xin này ñã ñóng vai trò quan trọng trong việc khống chế bệnh Tụ huyết trùng gia cầm Tuy nhiên, hiệu lực của văc xin trên gia cầm không ñồng ñều, khả năng bảo hộ không ổn ñịnh Bệnh vẫn thường xảy ra ở một số ñàn ñã ñược tiêm văc xin Vì vậy, một số tác giả sau này ñã nghiên cứu chế tạo văc xin nhược ñộc

Bierer và Derieux, 1972, Maheswaran và cộng sự, 1973 ñã chế tạo văc xin giảm ñộc chủng CU PM-1 và P-9 gây miễn dịch cho gia cầm bằng các pha vào nước uống

Rimler, 1987 chế tạo văc xin bằng cách nuôi cấy P.multocida trên ñộng vật với 5

serotype Theo Heddleston và Rebers, 1975 văc xin chết không gây ñược miễn dịch chéo giữa các serotype, còn văc xin sống nhược ñộc lại gây ñược miễn dịch phòng hộ chéo giữa các serotype gây bệnh Tụ huyết trùng gia cầm Tuy nhiên, việc làm giảm ñộc lực của

mầm bệnh ñể chế tạo văc xin có dẫn ñến nguy cơ P.multocida nhược ñộc trong văc xin

có thể ñược phục hồi ñộc lực ñể trở lại thành cường ñộc hay không, gia cầm ñược tiêm văc xin lại trở thành nguồn mang bệnh gây ra những ổ dịch ở ñịa phương vẫn ñang còn là vần ñề gây tranh cãi (Hofacre, 1986) Cho ñến nay, cơ chế tạo miễn dịch cũng như loại kháng nguyên ñặc hiệu của vi khuẩn tham gia vào quá trình tạo miễn dịch phòng hộ ở gia cầm ñược tiêm văc xin vẫn chưa ñược xác ñịnh rõ ràng Mặc dù Lipopolysaccharide (LPS) ñược xem là loại kháng nguyên quan trọng trong sơ ñồ xác ñịnh serotype của

P.multocida, nhưng vai trò của nó trong quá trình ñáp ứng miễn dịch vẫn còn nhiều ñiều

bí ẩn (Rimler và Rhoades, 1987)

Nghiên cứu về khả năng gây bệnh của P.mutocida người ta thấy khi nuôi cấy trong

ñiều kiện thiếu sắt P.mutocida sẽ sản sinh những protein ñiều chỉnh tạo sắt trong protein

vật chủ ðây chính là yếu tố gây bệnh của P.multocida, những protein này gọi là protein

màng ngoài (Outer Membrane Protein – OMPs), chúng thường có trọng lượng phân tử khoảng 96,84,80 Kda (Snipes, 1988) hoặc 94,84,76 Kda phụ thuộc vào ñiều kiện vi khuẩn phát triển trong môi trường có thêm sắt (Choi, 1991) Những protein này ñóng vai

trò quan trọng trong quá trình miễn dịch phòng vệ chéo giữa các serotype P.multocida

gây bệnh Tụ huyết trùng cho gia súc gia cầm (Kennett, 1993; Glisson, 1993)

Những kết quả nghiên cứu trên ñã ñược Carmel và cộng sự (1996) vận dụng ñể nghiên cứu văc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng gia cầm Trong ñó, bên cạnh kháng nguyên thân thì kháng nguyên giáp mô, kháng nguyên OMPs ñã ñược quan tâm nghiên cứu, áp dụng vào chế tạo văc xin nhằm nâng cao hiệu quả phòng bệnh của văc xin Trong những năm gần ñây ñã có nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu các chất

bổ trợ nhằm cải thiện chất lượng văc xin Mặt khác, việc áp dụng các công nghệ kỹ thuật mới trong công tác sản xuất văc xin như: Công nghệ lên men sục khí, kỹ thuật sinh học phân tử cũng ñang ñược nhiều nhà khoa học quan tâm

Các chất bổ trợ dùng trong sản xuất văc xin gồm các nhóm sau:

- Nhóm chất vô cơ: gồm các chất như Hydroxit aluminum Al(OH)3, Phosphat aluminum AlPO4, Cloruacanxi CaCl2.6H2O

- Nhóm chất hữu cơ: gồm những chất chủ yếu như Protamin, Gelatin, mỡ ñộng vật, dầu thực vật, dầu khoáng, Saponin tanin, colesterin

- Những chất khác: Thành tế bào vi khuẩn như BCG và một số vi khuẩn thuộc nhóm

Mycobacterium Bên cạnh ñó là các chất tổng hợp như MDP (Moramyldipeptide), GMDP (Glucosamininmuramyldipeptide)

Trong các chất bổ trợ kể trên thì chất bổ trợ dầu khoáng ñang ñược quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi, cho phép tạo ra các loại văc xin cho hiệu lực cao và thời gian

miễn dịch kéo dài

1.5.3 Ứng dụng công nghệ tiên tiến trong sản xuất văc xin

Chế tạo văc xin bằng công nghệ sinh học

* Ứng dụng công nghệ gen trong chế tạo văc xin: Công nghệ sinh học ñã và ñang có những bước phát triển mạnh mẽ, cho phép các nhà khoa học chế tạo ñược một thế hệ văc xin tổng hợp tiên tiến, thể hiện ưu thế vượt trội so với văc xin truyền thống

Công trình nghiên cứu của Watson và Crick về DNA cho phép chúng ta hiểu biết rõ hơn về gen Nhiều thông tin di truyền của vi sinh vật ñược giải mã Phương pháp tái tổ hợp DNA tạo ñiều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu về gen vì nó hoạt ñộng như một máy photocopy sinh học, tạo ñược gen mong muốn Trong công nghệ gen, người ta phải dùng Plasmid - cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể Hầu hết, chúng phân lập ñược từ

vi khuẩn chứa vòng kép DNA, các chuỗi xoắn kép này ñược mở ra nhờ enzym rồi ñược cấy ghép bằng một ñoạn DNA cần nghiên cứu, hoặc DNA cần thiết ñể chế tạo văc xin rồi ñưa vào vi khuẩn Nhờ ñó, ñoạn DNA cần thiết ñược nhân lên liên tục trong vi khuẩn E.coli là loại vi khuẩn ñược các nhà khoa học lựa chọn ñể thực hiện kỹ thuật này, chúng trở thành “nhà máy” sản xuất gen ñược các nhà nghiên cứu quan tâm

Vi khuẩn chứa Plasmid mang gen cấy ghép sẽ phát triển bình thường và ta sẽ thu ñược loại Protein mong muốn, có tính kháng nguyên gây miễn dịch ñặc hiệu với bệnh nào ñó ñịnh trước

Trong lĩnh vực thú y, loại văc xin ñầu tiên ñược sản xuất bằng công nghệ này là vắc xin Lở mồm long móng Tại hội nghị quốc tế do Tổ chức dịch tễ thế giới OIE họp tại Paris 9/1982 ñã công nhận thành tựu chế tạo văc xin Lở mồm long móng bằng công nghệ gen, ñược coi như một thành tựu chế tạo văc xin thế hệ mới

Ưu ñiểm nổi bật của loại văc xin thế hệ mới này là an toàn vì không chứa vi sinh vật gây bệnh ðặc biệt có ý nghĩa ñối với những vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm, tránh hiện tượng phát tán mầm bệnh ra ngoài môi trường và nguy cơ tạo thành ổ dịch

Chế tạo văc xin bằng phương pháp lên men sinh học

ðây cũng ñược xem là công nghệ chế tạo văc xin tiên tiến ñã và ñang ñược ứng

dụng thành công và khá hiệu quả ở nước ta Vi khuẩn ñược nuôi cấy trong hệ thống bình lên men sục khí, ñảm bảo các ñiều kiện tối ưu về pH, nhiệt ñộ và môi trường dinh dưỡng phù hợp sẽ cho ñậm ñộ vi khuẩn tăng cao gấp nhiều lần Từ ñó, có thể giảm liều văc xin

và mang lại hiệu quả kinh tế rất rõ ràng

ðối với virus, việc sử dụng hệ thống chai lăn trong quá trình nuôi cấy cũng cho hiệu quả tương tự

Một số tiến bộ công nghệ trong sản xuất văc xin ở nước ta

Những tiến bộ trong việc cải tiến quy trình công nghệ, áp dụng những công nghệ mới trong lĩnh vực sản xuất văc xin thú y ở nước ta

Có thể nói, công nghệ sản xuất văc xin thú y ở nước ta trong thời gian gầy ñây ñã ghi nhận những tiến bộ khả quan Hầu hết các ñơn vị sản xuất văc xin trong nước ñã mạnh dạn trong ñầu tư trang thiết bị hiện ñại, tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ tiên tiến và từng bước làm chủ quy trình công nghệ Trong ñó, văc xin vi trùng ñược sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí với thiết bị nhập khẩu hiện ñại, quy trình khép kín Văc xin virus bắt ñầu ñược quan tâm nghiên cứu và sản xuất trên môi trường tế bào nuôi cấy nhân tạo cho hiệu quả cao hơn

Việc quan tâm nghiên cứu cải thiện chất lượng văc xin bằng chất bổ trợ cũng là một hướng ñi ñúng ñắn Trong ñó, nổi bật nhất phải kể ñến kỹ thuật sản xuất văc xin dạng nhũ dầu ñã mang lại những cải thiện rõ rệt về ñộ dài miễn dịch hay thời gian bảo hộ của văc xin

Văc xin nhũ dầu giúp kháng nguyên tồn tại lâu hơn tại vị trí tiêm, bảo vệ kháng nguyên khỏi sự phân hủy của enzym mô bào, tránh sự ñào thải của cơ thể và hệ thống miễn dịch Do vậy, kích thích sinh ñáp ứng miễn dịch tích lũy kéo dài, cho thời gian bảo

hộ dài hơn so với văc xin thông thường ðây cũng ñược xem là công nghệ mới mang tính ñột phá mà một số ñơn vị sản xuất văc xin ñã và ñang mạnh dạn áp dụng

1.5.4 Các loại văc xin Tụ huyết trùng gia cầm

Một số loại văc xin tụ huyết trùng gia cầm trên thế giới

* Văc xin Tụ huyết trùng gia cầm nhược ñộc “P.multocida-live” Type1

được sản xuất bởi hãng VINELAND (Hoa kỳ) là loại văc xin uống, sử dụng 2 lần: Lần 1 lúc 6-12 tuần tuổi, lần 2 lúc 18-20 tuần tuổi

* Văc xin vô hoạt nhũ dầu FC-3 do hãng Maine Biologycal Laboratories (Hoa kỳ)

sản xuất với 3 serotype P.multocida là A1, A3 và A4 dùng tiêm cho gà giống tại hai thời

ựiểm: Lần 1 lúc 12-16 tuần tuổi và lần 2 sau lần 1 4-6 tuần, liều tiêm 0,5ml/con

* Văc xin nhũ dầu ựa giá kết hợp ỘNeotypehomixỢ do hãng Rhone Merieux (Pháp)

sản xuất gồm P.multocida type A3 và E.coli type 01, 02 và 078 Tiêm dưới da 0,3ml/con

cho gà 3-4 tháng tuổi

Nghiên cứu chế tạo văc xin Tụ huyết trùng gia cầm ở Việt Nam

Do ựặc thù khắ hậu nhiệt ựới gió mùa, thời tiết trong năm biến ựộng theo mùa, nên bệnh Tụ huyết trùng ở gia súc, gia cầm ở nước ta thường xuyên xảy ra và gây lên những thiệt hại không nhỏ cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia cầm nói riêng Chắnh

vì vậy, công tác nghiên cứu, chế tạo văc xin phòng bệnh ựã thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trong nước Những công trình nghiên cứu khoa học ựó ựã góp phần rất quan trọng giúp ngành thú y nước ta làm chủ và phát triển công nghệ sản xuất văc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng cho gia súc, gia cầm

* Năm 1991, Phan Thanh Phượng ựã phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm ở các tỉnh miền Bắc gồm: HN1, HN2, TT2, TT46, GL3, GL4, N15 Qua nghiên cứu tác giả nhận thấy các chủng phân lập ựược ựều cùng Serotype với

chủng 41 và thuộc P.multocida Serotype A:1

* Trần đình Từ và cộng sự, 1992 ựã ựiều tra phân lập vi khuẩn Pasteurella mutocida

gây bệnh tụ huyết trùng ở khu vực Thừa Thiên Ờ Huế, tỷ lệ mắc tụ huyết trùng gia cầm là 22,8%

* Theo các nghiên cứu của Phùng Duy Hồng Hà, 1990 và Nguyễn Xuân Bình, 1996 cho thấy các chủng gây bệnh tụ huyết trùng cho gia cầm ở Long An và các tỉnh phắa Nam

thuộc Serotype A:1 của vi khuẩn P.multocida

* Theo nghiên cứu của Dương Thế Long và Lê Văn Tạo, 1995 về tụ huyết trùng ở Sơn La cho thấy Serotype kháng nguyên capsules bằng phương pháp phi miễn dịch ựã ựi ựến kết luận: Mẫu Q16 là P.multocida type A, còn mẫu M36 thuộc type D theo sự phân

loại của Carter

* Phan Thanh Phượng ,1993 ñã nghiên cứu chế tạo văc xin Tụ huyết trùng gia cầm

từ chủng N41, xác nhận môi trường tụy tự tiêu Hottinger là môi trường phù hợp ñể nuôi cấy vi khuẩn Tụ huyết trùng cho ñậm ñộ cao, sau 8 giờ nuôi cấy số lượng vi khuẩn ñạt 26,5 tỷ/ml Từ ñó, khi chế tạo văc xin có thể giảm liều tiêm từ 2-3ml/con xuống còn 0,5ml/con, rất thích hợp cho việc tiêm phòng tụ huyết trùng gia cầm ñại trà

* Lê Lập, 1996 nghiên cứu một số ñắc tính sinh học và miễn dịch của văc xin chế từ chủng N41 và các chủng P.multocida phân lập ở gia cầm nuôi tại một số tỉnh miền Trung

nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng văc xin

Hiện nay ở nước ta, văc xin Tụ huyết trùng gia cầm ñã và ñang ñược một số ñơn vị sản xuất và cung cấp ra thị trường

* Văc xin vô hoạt keo phèn Tụ huyết trùng gia cầm do Xí nghiệp Thuốc thú y TW

sản xuất từ giống P.multocida aviseptica

* Văc xin vô hoạt Tụ huyết trùng gia cầm với chất bổ trợ phèn chua, sản xuất từ

giống P.multocida type A:1 do Công ty CP Thuốc thú y TWII (Navetco) sản xuất

* Văc xin vô hoạt Tụ huyết trùng gia cầm chế từ chủng P.multocida PA.1 và PA.2

với chất bổ trợ keo phèn do Phân viện thú y miền Trung sản xuất

* ðặc biệt, văc xin vô hoạt Tụ huyết trùng gia cầm chế từ vi khuẩn cường ñộc

P.multocida chủng N41, ñược bất hoạt bằng Formaldehyde 0,3%, chất bổ trợ keo phèn (Hydroxite aluminum) do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và chuyển giao công nghệ thú

y - Viện Thú y Quốc gia sản xuất, là sản phẩm kế thừa những thành tựu nghiên cứu khoa học lâu năm của Viện Thú y, văc xin có chất lượng tốt và ñược phân phối rộng rãi trên thị trường