2.1.1.đối tượng
- Vi khuẩn P.multocida gây bệnh trên gia cầm - Chất bổ trợ dầu sử dụng trong chế tạo văc xin. - Gia cầm mẫn cảm với P.multocida
2.1.2.Nội dung
1. Giám ựịnh một sốựặc tắnh sinh vật, hóa học của vi khuẩn P.multocida N41
2. Nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật nhằm tối ưu hóa hiệu quả lên men sinh khối
P.multocida:
- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ựến hiệu quả nuôi cấy
- Ảnh hưởng của hàm lượng O2 hòa tan ựến hiệu quả và thời gian sinh khối 3. Thử nghiệm, lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu
4. Sản xuất thử nghiệm văc xin nhũ dầu tụ huyết trùng gia cầm: - Sản xuất thử nghiệm 5 lô văc xin
- đánh giá chất lượng văc xin (kiểm nghiệm)
5. Nghiên cứu ựặc tắnh sinh miễn dịch, ựộ dài miễn dịch của văc xin - đánh giá ựặc tắnh sinh miễn dịch lặp lại trên gà trưởng thành (gà dò) - đánh giá ựộ dài miễn dịch sau 6 tháng, so sánh với văc xin keo phèn.
2.2. địa ựiểm và thời gian nghiên cứu
địa ựiểm: Phòng Nghiên cứu và sản xuất văc xin vi trùng, Trung tâm Nghiên cứu
Ứng dụng và Chuyển giao Công nghệ Thú y, Viện Thú ỵ
Thời gian: Từ 1/7/2012 ựến 30/6/2013
2.3. Nguyên liệu
2.3.1.Vi sinh vật, sinh phẩm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 28 sinh vật, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Chuyển giao Công nghệ Thú y cung cấp). Theo hồ sơ gốc cho thấy: Chủng giống P.multocida N41ựã ựược Cục thú y và cơ quan quản lý cho phép sử dụng trong công tác sản xuất vắc xin và ựược sử dụng trong nhiều công trình nghiên cứu trước ựâỵ đặc biệt là các công trình nghiên cứu của GS.TSKH Phan Thanh Phượng và cs.
Gà dò sạch (1-1,2 kg) và âm tắnh với kháng nguyên Tụ huyết trùng: Do Trung tâm thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi Thụy Phương, Viện Chăn nuôi cung cấp
2.3.2.Môi trường
- Môi trường tổng hợp Blood Agar, BHI Agar và Sarbouro Agar do hãng Merck (Germany) cung cấp
- Brain Heart Infustion Broth, Yeast Extract, Meat ExtractẦ,do các hãng HiMedia Laboratories và Titan Media (India) cung cấp
- Huyết thanh cừu, huyết thanh bê, máu cừu do phòng chăn nuôi ựộng vật thắ nghiệm, Viện Thú Y cung cấp.
2.3.3.Hóa chất
- Dung dịch NaOH 1N, H2SO4 5% (Xuất xứ: Sigma Ờ Hoa Kỳ) - Formaldehyde (Xuất xứ: Sigma - Hoa Kỳ)
- Thimerosal (Xuất xứ: Sigma - Hoa Kỳ) - Antifoam 204 (Xuất xứ: Sigma - Hoa Kỳ)
- Chất bổ trợ: Dầu khoáng Montanide ISA 50V2, ISA Montanide 70M VG, ISA Montanide 760VG do công ty Seppic (Pháp) cung cấp
- Eolan 130, Sinofon Span 80, Sinofon Teen 85 do công ty Total (Pháp) cung cấp
2.3.4.Máy, thiết bị, vật liệu và dụng cụ
- Hệ thống lên men sục khắ tựựộng Bioflo 5000 Ờ 80 lắt (Hãng NBS Ờ Hoa Kỳ) - Máy lên men sục khắ BioStat B Ờ dung tắch 10 lắt (Hãng Satorius Ờ đức) - Thiết bị gây nhũ Ultra Turrax T50 Basic (Hãng IKA Ờ đức)
- Bình Schott các loại 500, 1000, 2000, 5000ml - Thiết bị chiết chai, chia liều (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 29 - Máy siết nút chai
- Pipetteman 100, 1000ộl, Pipette 8 kênh, các loại ựầu typ phù hợp. - Ống ly tâm, ựựng mẫu (Corning, Eppendorf)
- Lọ thủy tinh 20 ml, 50 ml - Nút cao su chịu dầu ; Nút nhôm - Seringe 1 ml, 5 ml, 10 ml...
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp kiểm ựịnh giống P.multocida N41
Kiểm ựịnh giống P.multocida N41 theo phương pháp thường quy với các chỉ tiêu: - đặc tắnh nuôi cấy trên các loại môi trường
- đặc tắnh dung quang của khuẩn lạc trên thạch huyết thanh
Ria cấy vi khuẩn trên ựĩa thạch huyết thanh 10%, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc riêng rẽ;
Quan sát khuẩn lạc dưới kắnh hiển vi với ựộ phóng ựại thấp (20x), góc chiếu ựèn chếch 450.
- đặc tắnh gây bệnh trên ựộng vật cảm thụ
Gây nhiễm vi khuẩn cho gà dò (gà trên 2 tháng tuổi, trọng lượng 0,8 Ờ 1,2 kg), liều 10LD50. Theo dõi tỷ lệ chết, thời gian gây chết gà. Phân lập vi khuẩn từ máu tim gà chết trên thạch máu và thạch huyết thanh.
- Xác ựịnh chỉ số LD50 theo phương pháp của theo Reed & Muench (1938).
2.4.2.Phương pháp xác ựịnh ựậm ựộ vi khuẩn
Chuẩn bị một dãy gồm 9 ống Eppendorf loại 1,5ml, ựầu typ loại 1000ộl và 100 ộl hấp, sấy vô trùng. Pipet tựựộng 1000 ộl và 100 ộl.
Tiến hành: Cho vào 9 ống Eppendorf mỗi ống 900 ộl nước sinh lý vô trùng, ựánh số
thứ tự từ 1-9. Trộn ựều mẫu canh khuẩn cần xác ựịnh ựậm ựộ, dùng pipet hút 100ộl canh khuẩn cho vào ống thứ nhất rồi trộn ựều bằng máy Vortex, thay ựầu typ rồi hút 100 ộl từ ống thứ nhất chuyển sang ống thứ hai và lại trộn ựều bằng VortexẦ tiếp tục làm như vậy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 30
ựến ống thứ 9. Như vậy ta ựược ựộ pha loãng canh khuẩn lần lượt là 10-1ựến 10-9, tương
ứng với các ống từ 1 ựến 9 theo hệ số pha loãng 10 lần.
Hình 2.01. Sơựồ pha loãng canh khuẩn
Chuẩn bị 9 ựĩa thạch máu ựánh số theo ựộ pha loãng ở các nồng ựộ 107, 108, 109 mỗi nồng ựộ 3 ựĩạ Dùng pipet hút 100ộl canh khuẩn ở từng nồng ựộ pha loãng tương ứng nhỏ lên mỗi ựĩa, láng ựều lên mặt thạch. để tủấm 370C/18-20h. đếm số lượng khuẩn lạc trên từng ựĩa ở các ựộ pha loãng khác nhau và xác ựịnh số lượng vi khuẩn có trong 1ml canh khuẩn ban ựầu theo công thức:
X = a x N x 10
Trong ựó: X là số lượng vi khuẩn có trong 1ml canh khuẩn ban ựầu
a là số khuẩn lạc trung bình ựếm ựược trong 100 ộl canh khuẩn ở mỗi nồng ựộ pha loãng tương ứng.
N là nồng ựộ pha loãng canh khuẩn
(Lấy kết quả trung bình xác ựịnh tại 3 nồng ựộ pha loãng làm kết quả cuối cùng)
2.4.3.Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hóa lý của văc xin
Các chỉ tiêu hóa lý của nhũ dầu như: độ nhớt (Viscosity), kắch thước hạt nhũ
(Dropletsize) có ựược nhờ thiết bịựo chuyên dụng do Seppic thực hiện.
Droptest: Là phương pháp cho phép xác ựịnh ựộ bền của nhũ dầu trong môi trường nước. Dùng Pipette hút nhũ dầu và nhỏ một giọt vào cốc nước. Theo dõi thời gian phân tán của giọt nhũ dầu vào trong nước làm cơ sởựánh giá chất lượng nhũ. Thời gian phân tán càng chậm nhũ dầu càng bền vững và sẽ cho chất lượng văc xin tốt hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.4.Phương pháp xác ựịnh chỉ tiêu an toàn văc xin
Tiêm dưới da 2 ml văc xin/con cho 05 gà dò khỏe mạnh, ≥ 2 tháng tuổi, trọng lượng 1 Ờ 1,2 kg. Sau ắt nhất 10 ngày theo dõi ựánh giá chỉ tiêu an toàn văc xin thông qua tỷ lệ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 31
ựạt 100%.
2.4.5.Phương pháp xác ựịnh chỉ tiêu hiệu lực của văc xin
Mỗi lô văc xin cần kiểm tra, tiêm 0,5 ml văc xin/con cho 10 gà dò, vị trắ tiêm dưới dạ Lô ựối chứng 10 gà dò khỏe mạnh không ựược tiêm văc xin.
Nuôi dưỡng chăm sóc tốt cho gà, 28 ngày sau khi tiêm văc xin tất cả gà ở lô thắ nghiệm và ựối chứng ựược thử thách với vi khuẩn P.multocida chủng N41 cường ựộc với liều tiêm 10LD50, vị trắ tiêm dưới dạ
Sau khi tiêm vi khuẩn cường ựộc, chăm sóc và theo dõi gà trong thời gian 7-10 ngày, ghi chép số gà chết tại các lô. Kết quảựạt yêu cầu khi gà ở lô ựối chứng chết 100% (phân lập ựược vi khuẩn P.multocida từ máu tim gà chết). đánh giá tỷ lệ bảo hộ của văc xin ựối với gà là tỷ lệ (%) theo công thức sau:
2.4.6.Phương pháp xác ựịnh ựáp ứng miễn dịch và ựộ dài miễn dịch
đáp ứng miễn dịch và ựộ dài miễn dịch của văc xin ựược xác ựịnh bằng phản ứng IHA, tóm tắt theo nguyên lý như sau:
Kháng nguyên hòa tan (K) của vi khuẩn P.multocida ựược gắn lên bề mặt hồng cầu cừu thông qua thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết của hồng cầu, có thể quan sát ựược bằng mắt thường theo mô hình sau:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 32
Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng
- Huyết thanh gà sau khi ựược tiêm văc xin Tụ huyết trùng gia cầm nhũ dầu: Lấy máu gà tại thời ựiểm 21 ngày sau khi tiêm văc xin và tại các thời ựiểm cần xác ựịnh hiệu giá kháng thể, chắt lấy huyết thanh, ly tâm, loại bỏ hồng cầu, chia ống 0,5ml, bảo quản ở
nhiệt ựộ -300C nếu không tiến hành phản ứng ngaỵ
- Hồng cầu cừu ựược lấy chống ựông trong dung dịch Alserve, rửa hồng cầu 3 lần với 10 lần thể tắch dung dịch PBS, ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút. Sau lần rửa cuối cùng, trộn hồng cầu với PBS ựể tạo dung dung dịch có chứa 10% hồng cầu và bảo quản ở
40C ựể sử dụng làm phản ứng.