C Khả năng gây bệnh cho gà trên 2 tháng tuổi 1 LD50 180 ñơn vị khuẩn lạc
3 Tái phân lập vi khuẩn từ
3.2.1. Ảnh hưởng của chất lượng môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn
Môi trường nuôi cấy phù hợp là yếu tố cần thiết ñểñảm bảo ñậm ñộ vi khuẩn sau quá trình lên men ñạt kết quả tốt. Kết quả lên men sinh khối sẽ quyết ñịnh chất lượng văc xin và hiệu quả kinh tế trong sản xuất văc xin.
Trước ñây, theo truyền thống môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong sản xuất văc xin Tụ huyết trùng, môi trường giàu ñạm chế từ thịt bò thường ñược sử dụng. Quá trình tối
ưu hóa quy trình nuôi cấy sử dụng môi trường Hottinger chế từ thịt bò tự tiêu bằng men tụy cho biết (i) thành phần môi trường có ảnh hưởng trực tiếp sản lượng lên men và (ii)
ñây là loại môi trường dinh dưỡng phù hợp nhất ñể nuôi cấy vi khuẩn tụ huyết trùng. Kết hợp với sục khí, các tác giả trước ñây ñã tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy và ñạt ñược 26,5 x 109 tế bào vi khuẩn/ml canh khuẩn (Phan Thanh Phượng và cs, 1993).
Ngày nay, môi trường nuôi cấy vi khuẩn ñã ñược thương mại hóa rộng rãị Môi trường chế sẵn ñược sản xuất công nghiệp có những ưu ñiểm vượt trội so với môi trường Hottinger như: Chất lượng ổn ñịnh, ñộ tinh khiết cao và thuận tiện trong quá trình sử dụng và bảo quản; tuy nhiên, giá thành cho một ñơn vị thể tích môi trường nuôi cấy cao hơn so với môi trường Hottinger sử dụng tụy tiêu hóa thịt bò. Hơn nữa, hiện có rất nhiều công ty trên thế giới sản xuất và cung cấp môi trường bột chế sẵn với sựña dạng về chủng loạị
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 38
ðể có năng suất sinh khối cao, trong thí nghiệm này chúng tôi so sánh thành phần môi trường trong cùng ñiều kiện sinh khối ñểñánh giá ảnh hưởng của môi trường ñến sự
phát triển của vi khuẩn và tìm ra công thức môi trường tối ưu nhất. Chúng tôi ñã tiến hành 3 công thức chuẩn bị môi trường ñối với mỗi hãng cung cấp nguyên liệu và thử nghiệm với môi trường từ nhà cung cấp khác nhaụ
Bảng 3.02. Thành phần môi trường thử nghiệm
Thành phần (g/lít) Công thức I Công thức II Công thức III
Brain Heart Broth 37.0 37,0 37,0
Yeast extract 0 13,0 13,0
Meat extract 0 0 8,0
Huyết thanh bê 10% 10% 10%
Tại công thức I chúng tôi chỉ sử dụng ñơn thuần nguyên liệu cơ bản là môi trường BHI với hàm lượng 37g/lít (thành phần khuyến cáo).
ðối với công thức II chúng tôi bổ sung thêm Yeast extract (cao nấm men) với hàm lượng 13g/lít
Trong công thức III, chúng tôi làm giàu môi trường bằng cách bổ sung thêm vào công thức II 8g Meat extract trong mỗi lít môi trường nuôi cấỵ
Môi trường sau khi pha chếñược thanh trùng tại nhiệt ñộ 1210C/15 phút, làm mát tới nhiệt ñộ 370C, bổ sung thêm 10% huyết thanh bê vô trùng trước khi truyền cùng một thể tích giống ñể nuôi cấỵ
Ba công thức chuẩn bị môi trường nêu trên ñược áp dụng cho nguyên liệu của 3 nhà sản xuất: Mecrk (ðức), Himedia Laboratories (Ấn ðộ) và TiTan Media (Ấn ðộ). Tất cả các thí nghiệm ñược ñều ñược thực hiện trên hệ thống nuôi cấy tựñộng Bioflo 5000 với cùng chương trình lên men ñã lập trình. Mỗi thí nghiệm
ñược lặp lại 3 lần; kết quả sinh khối (trung bình cộng log [CFU/ml]) ñược so sánh tại bảng 3.03 và minh họa tại biểu ñồở hình 3.01.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 39
Bảng 3.03. Ảnh hưởng của môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn
ðậm ñộ vi khuẩn (x109CFU/ml)
Hãng
sản xuất Công thức I Công thức II Công thức III Merck 26,5 ± 0,93 28,0 ± 0,94 28,0 ± 0,93
Himedia 21,0 ± 1,00 26,0 ± 0,87 27,5 ± 0.87
Titan 15,5 ± 0,81 19,0 ± 0,94 22,0 ± 0,81 Kết quả thể hiện trên bảng 3.03 cho thấy:
(1) ðối với mỗi nguồn nguyên liệu, ñậm ñộ vi khuẩn luôn ñạt cao nhất ở
công thức III, kế ñó là công thức II và thấp nhất là ở công thức Ị Kết quả này chứng tỏ việc bổ sung cao nấm men và cao thịt tương quan thuận với năng suất sinh khối của vi khuẩn P.multocidạ
ðiều ñó cho thấy, việc bổ sung Yeast extract, Meat extract trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn P.multocida N41 là cần thiết ñể có ñược canh khuẩn nuôi cấy với ñậm ñộ vi khuẩn caọ ðặc biệt là Yeast extract (Cao nấm men). Sau khi ñược bổ sung Yeast extract, ñậm ñộ vi khuẩn tăng lên rõ rệt so với khi chưa ñược bổ
sung.
Yeast extract là sản phẩm tinh chế có ñược từ việc nuôi cấy nấm men, ñây là nguồn cung cấp acid amin, vitamin và protein thiết yếu cho hoạt ñộng tăng sinh của vi khuẩn. Chính vì thế, ñây là thành phần quan trọng cần thiết ñược bổ sung trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn ñể có ñược canh khuẩn ñậm ñộ caọ
Biểu ñồ tại hình 3.01 sau ñây thể hiện rõ sự khác biệt về hiệu quả sinh khối ở
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 40
Hình 3.01. Biểu ñồ biến ñộng năng suất sinh khối (log CFU/ml) theo thành phần và nguồn gốc môi trường
(2) Kết quả thu ñược tại bảng 3.03 và biểu ñồở hình 3.01 cũng cho thấy ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu ñến sinh khối là rõ rệt, phản ánh mức ñộ thích ứng của
P.multocida ñối với nguyên liệu BHI do các hãng khác nhau chuẩn bị.
- ðối với công thức cơ bản (công thức I), môi trường Merck cho sinh khối 26,5 ± 0,93 x 109 CFU, cao hơn hẳn so với môi trường Himedia (21,0 ± 1,00 x 109 CFU/ml) và Titan (15,5 ± 0,81 x 109 CFU/ml). Kết quả này chứng tỏ môi trường BHI của hãng Merck là phù hợp nhất ñối với nuôi cấy P.multocida N41.
- Việc bổ sung Yeast extract làm tăng chất lượng lên men một cách rõ rệt ñối với BHI của Himedia (từ 21 lên 26 tỷ vi khuẩn/ml), và tương tựñối với môi trường của hãng Titan (từ 15,5 lên 19 tỷ vi khuẩn/ml). Tác dụng này ít rõ rệt hơn ñối với môi trường có nguồn gốc từ Merck (từ 26,5 lên 28,0 tỷ vi khuẩn/ml). Kết quả này chứng tỏ Yeast extract là rất quan trọng ñối với lên men sinh khối P.multocida N41. Sự khác biệt nhỏñối với môi trường Merck có thể do mật ñộ vi khuẩn ñã gần ñạt ñến mức tối ña cho phép trong ñiều kiện lên men ñã xác lập.
Tương tự, việc bổ sung Meat extract cũng cải thiện năng suất lên men với ñậm ñộ vi khuẩn cao hơn công thức II trong trường hợp môi trường có nguồn gốc từ Himedia và Titan, nhưng không có sự khác biệt trong trường hợp sử dụng môi trường BHI cơ bản từ
Merck. Cũng có thể, mật ñộ 28 tỷ vi khuẩn ñược xem là cực ñại trong ñiều kiện lên men
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 41 Meat extreact không có hiệu quả.
Xét về hiệu quả kinh tế chúng tôi nhận thấy, sử dụng môi trường do Himedia sản xuất cho hiệu quả cao nhất vì tại thời ñiểm thí nghiệm giá thành môi trường nguyên liệu của Merck cao gấp 2,5 – 3 lần so với Himedia và TiTan. Trong khi ñó, Himedia và TiTan có giá thành tương ñương nhưng hiệu quả nuôi cấy vi khuẩn khi dùng môi trường của Himedia cao hơn nhiều so với TiTan.
Qua những kết quả trên ñây chúng tôi nhận ñịnh môi trường do Himedia (Ấn ðộ) sản xuất là phù hợp nhất ñể sản xuất kháng nguyên P.multocida chủng N41 trên quy mô lớn.