C Khả năng gây bệnh cho gà trên 2 tháng tuổi 1 LD50 180 ñơn vị khuẩn lạc
3 Tái phân lập vi khuẩn từ
3.2.1. Ảnh hưởng của chất lượng môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn
Môi trường nuôi cấy phù hợp là yếu tố cần thiết ñể ñảm bảo ñậm ñộ vi khuẩn sau quá trình lên men đạt kết quả tốt. Kết quả lên men sinh khối sẽ quyết ñịnh chất lượng văc xin và hiệu quả kinh tế trong sản xuất văc xin.
Trước đây, theo truyền thống mơi trường ni cấy vi khuẩn trong sản xuất văc xin Tụ huyết trùng, môi trường giàu đạm chế từ thịt bị thường được sử dụng. Q trình tối
ưu hóa quy trình ni cấy sử dụng mơi trường Hottinger chế từ thịt bị tự tiêu bằng men
tụy cho biết (i) thành phần môi trường có ảnh hưởng trực tiếp sản lượng lên men và (ii)
đây là loại mơi trường dinh dưỡng phù hợp nhất để ni cấy vi khuẩn tụ huyết trùng. Kết
hợp với sục khí, các tác giả trước đây đã tối ưu hóa điều kiện ni cấy và đạt ñược 26,5 x 109 tế bào vi khuẩn/ml canh khuẩn (Phan Thanh Phượng và cs, 1993).
Ngày nay, môi trường ni cấy vi khuẩn đã được thương mại hóa rộng rãị Mơi
trường chế sẵn được sản xuất cơng nghiệp có những ưu điểm vượt trội so với mơi trường Hottinger như: Chất lượng ổn ñịnh, ñộ tinh khiết cao và thuận tiện trong quá trình sử dụng và bảo quản; tuy nhiên, giá thành cho một ñơn vị thể tích mơi trường ni cấy cao hơn so với mơi trường Hottinger sử dụng tụy tiêu hóa thịt bị. Hơn nữa, hiện có rất nhiều cơng ty trên thế giới sản xuất và cung cấp môi trường bột chế sẵn với sự ña dạng về chủng loạị
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… 38
ðể có năng suất sinh khối cao, trong thí nghiệm này chúng tơi so sánh thành phần
mơi trường trong cùng điều kiện sinh khối để đánh giá ảnh hưởng của mơi trường đến sự phát triển của vi khuẩn và tìm ra cơng thức mơi trường tối ưu nhất. Chúng tơi đã tiến hành
3 cơng thức chuẩn bị mơi trường đối với mỗi hãng cung cấp nguyên liệu và thử nghiệm với môi trường từ nhà cung cấp khác nhaụ
Bảng 3.02. Thành phần mơi trường thử nghiệm
Thành phần (g/lít) Cơng thức I Công thức II Công thức III
Brain Heart Broth 37.0 37,0 37,0
Yeast extract 0 13,0 13,0
Meat extract 0 0 8,0
Huyết thanh bê 10% 10% 10%
Tại công thức I chúng tơi chỉ sử dụng đơn thuần ngun liệu cơ bản là mơi trường BHI với hàm lượng 37g/lít (thành phần khuyến cáo).
ðối với công thức II chúng tôi bổ sung thêm Yeast extract (cao nấm men)
với hàm lượng 13g/lít
Trong cơng thức III, chúng tơi làm giàu môi trường bằng cách bổ sung thêm vào công thức II 8g Meat extract trong mỗi lít mơi trường ni cấỵ
Mơi trường sau khi pha chế được thanh trùng tại nhiệt ñộ 1210C/15 phút, làm mát tới nhiệt ñộ 370C, bổ sung thêm 10% huyết thanh bê vô trùng trước khi truyền cùng một thể tích giống để ni cấỵ
Ba cơng thức chuẩn bị mơi trường nêu trên được áp dụng cho nguyên liệu
của 3 nhà sản xuất: Mecrk (ðức), Himedia Laboratories (Ấn ðộ) và TiTan Media (Ấn ðộ). Tất cả các thí nghiệm được đều được thực hiện trên hệ thống ni cấy tự động Bioflo 5000 với cùng chương trình lên men đã lập trình. Mỗi thí nghiệm
được lặp lại 3 lần; kết quả sinh khối (trung bình cộng log [CFU/ml]) ñược so
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 39
Bảng 3.03. Ảnh hưởng của mơi trường đến đậm độ vi khuẩn
ðậm ñộ vi khuẩn (x109CFU/ml)
Hãng
sản xuất Công thức I Công thức II Công thức III Merck 26,5 ± 0,93 28,0 ± 0,94 28,0 ± 0,93
Himedia 21,0 ± 1,00 26,0 ± 0,87 27,5 ± 0.87
Titan 15,5 ± 0,81 19,0 ± 0,94 22,0 ± 0,81 Kết quả thể hiện trên bảng 3.03 cho thấy:
(1) ðối với mỗi nguồn nguyên liệu, ñậm ñộ vi khuẩn luôn ñạt cao nhất ở
cơng thức III, kế đó là cơng thức II và thấp nhất là ở công thức Ị Kết quả này
chứng tỏ việc bổ sung cao nấm men và cao thịt tương quan thuận với năng suất sinh khối của vi khuẩn P.multocidạ
ðiều đó cho thấy, việc bổ sung Yeast extract, Meat extract trong môi trường
nuôi cấy vi khuẩn P.multocida N41 là cần thiết để có được canh khuẩn ni cấy với đậm độ vi khuẩn caọ ðặc biệt là Yeast extract (Cao nấm men). Sau khi ñược bổ sung Yeast extract, ñậm ñộ vi khuẩn tăng lên rõ rệt so với khi chưa ñược bổ
sung.
Yeast extract là sản phẩm tinh chế có được từ việc ni cấy nấm men, đây là nguồn cung cấp acid amin, vitamin và protein thiết yếu cho hoạt động tăng sinh của vi khuẩn. Chính vì thế, ñây là thành phần quan trọng cần thiết ñược bổ sung trong môi trường nuôi
cấy vi khuẩn để có được canh khuẩn đậm độ caọ
Biểu đồ tại hình 3.01 sau đây thể hiện rõ sự khác biệt về hiệu quả sinh khối ở các công thức môi trường của 3 nhà cung cấp.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… 40
Hình 3.01. Biểu đồ biến động năng suất sinh khối (log CFU/ml) theo thành phần và nguồn gốc mơi trường
(2) Kết quả thu được tại bảng 3.03 và biểu đồ ở hình 3.01 cũng cho thấy ảnh hưởng
của nguồn nguyên liệu ñến sinh khối là rõ rệt, phản ánh mức độ thích ứng của
P.multocida ñối với nguyên liệu BHI do các hãng khác nhau chuẩn bị.
- ðối với công thức cơ bản (công thức I), môi trường Merck cho sinh khối 26,5 ± 0,93 x 109 CFU, cao hơn hẳn so với môi trường Himedia (21,0 ± 1,00 x 109 CFU/ml) và Titan (15,5 ± 0,81 x 109 CFU/ml). Kết quả này chứng tỏ môi trường BHI của hãng Merck là phù hợp nhất đối với ni cấy P.multocida N41.
- Việc bổ sung Yeast extract làm tăng chất lượng lên men một cách rõ rệt ñối với BHI của Himedia (từ 21 lên 26 tỷ vi khuẩn/ml), và tương tự đối với mơi trường của hãng Titan (từ 15,5 lên 19 tỷ vi khuẩn/ml). Tác dụng này ít rõ rệt hơn đối với mơi trường có nguồn gốc từ Merck (từ 26,5 lên 28,0 tỷ vi khuẩn/ml). Kết quả này chứng tỏ Yeast
extract là rất quan trọng ñối với lên men sinh khối P.multocida N41. Sự khác biệt nhỏ ñối với mơi trường Merck có thể do mật độ vi khuẩn ñã gần ñạt ñến mức tối ña cho phép trong ñiều kiện lên men ñã xác lập.
Tương tự, việc bổ sung Meat extract cũng cải thiện năng suất lên men với ñậm ñộ vi
khuẩn cao hơn cơng thức II trong trường hợp mơi trường có nguồn gốc từ Himedia và Titan, nhưng khơng có sự khác biệt trong trường hợp sử dụng môi trường BHI cơ bản từ Merck. Cũng có thể, mật độ 28 tỷ vi khuẩn ñược xem là cực ñại trong ñiều kiện lên men
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 41 Meat extreact khơng có hiệu quả.
Xét về hiệu quả kinh tế chúng tôi nhận thấy, sử dụng môi trường do Himedia sản xuất cho hiệu quả cao nhất vì tại thời điểm thí nghiệm giá thành mơi trường ngun liệu
của Merck cao gấp 2,5 – 3 lần so với Himedia và TiTan. Trong khi đó, Himedia và TiTan có giá thành tương đương nhưng hiệu quả ni cấy vi khuẩn khi dùng môi trường của Himedia cao hơn nhiều so với TiTan.
Qua những kết quả trên ñây chúng tôi nhận định mơi trường do Himedia (Ấn ðộ) sản xuất là phù hợp nhất ñể sản xuất kháng nguyên P.multocida chủng N41 trên quy mô lớn.