Dùng một lượng tương đương về thể tích giữa kháng ngun hịa tan vừa chế được với hồng cầu cừu, trộn ñều và ủ hỗn hợp dung dịch trên ở 370C trong 2 giờ. Sau đó, dùng 10 lần thể tích PBS để rửa hồng cầu bằng cách ly tâm với tốc độ 1500 vịng/phút trong 5 phút, rửa 3 lần. Sau lần cuối cùng, pha hồng cầu với dung dịch PBS có chứa 0,25% albumin huyết thanh bị (BSA-PBS) để thu được dung dịch có chứa 0,5% hồng cầu cừụ
- Chuẩn bị đĩa 96 giếng có đáy chữ U, 50µl huyết thanh gà được xác định khơng có kháng thể kháng vi khuẩn P.multocida để làm đối chứng âm, 50µl kháng huyết thanh kháng vi khuẩn P.mutocida chủng N41 ñể làm ñối chứng dương.
Tiến hành phản ứng:
Dùng Micropipet cho vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50µl dung dịch PBS-0,25% BSA). Sau đó, tại dãy giếng số 1 cho vào mỗi giếng 50µl huyết thanh của từng mẫu cần xét nghiệm. Riêng giếng 1G cho 50µl kháng huyết thanh chuẩn để làm đối chứng dương,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 33 giếng 1H cho 50µl huyết thanh gà đã được xác định khơng có kháng thể kháng vi khuẩn
P.multocida làm đối chứng âm.
Dùng Micropipet trộn ñều dãy giếng số 1 khoảng 15 lần ta được huyết thanh pha lỗng 2 lần, hút 50µl từ dãy giếng số 1 chuyển sang dãy giếng số 2, trộn ñều và tiếp tục làm như vậy cho ñến dãy giếng cuối cùng, hút bỏ đi 50µl.
Dùng Micopipet cho vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50µl hồng cầu đã gắn kháng ngun.
Dùng máy lắc ñĩa 96 giếng, lắc trong 40 giây ñể trộn ñều các thành phần. Sau đó, ñể yên ñĩa tại nhiệt độ phịng có nắp đậỵ Sau 2 giờ, đọc kết quả lần 1 và sau 4 -8 giờ ñọc kết quả lần 2.
Thành phần phản ứng chi tiết tại bảng 2.01:
Bảng 2.01. Thành phần phản ứng IHA ðơn vị tính thể tích: µl Thứ tự giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 đ PBS-0,25%BSA 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 HT nghi 50 TN HC-KN 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 đ PBS-0,25%BSA 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 KHT chuẩn 50 ð/C (+) HC-KN 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 đ PBS-0,25%BSA 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 HTgà (-) với THT 50 ð/C (-) HC-KN 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Chú thích: