C Khả năng gây bệnh cho gà trên 2 tháng tuổi 1 LD50 180 ñơn vị khuẩn lạc
3 Tái phân lập vi khuẩn từ
3.2.2. Xác ñịnh hàm lượng oxy hòa tan (DO) tối ưu
Lên men sục khí sinh học được xem là giải pháp công nghệ tiên tiến trong sản xuất văc xin vi trùng. Công nghệ này cho phép chúng ta nâng cao đậm độ vi khuẩn khi ni cấy sinh khối, tăng hàm lượng kháng nguyên trong một ñơn vị thể tích văc xin, từ đó
giảm liều tiêm cũng như hạ giá thành/liều văc xin. Quá trình lên men sục khí được thực hiện trên hệ thống thiết bị hồn tồn tự động trong việc đảm bảo các điều kiện ni cấy
như: nhiệt độ, độ pH, hàm lượng O2 hịa tan (DO)…
ðiều kiện ni cấy phù hợp nhất ñối với P.multocida là ở nhiệt ñộ 370C và pH 7,20. Hàm lượng O2 hòa tan (DO) tối ưu là một chỉ tiêu chưa được xác định. Do đó, chúng tơi tiến hành các nghiên cứu nhằm khảo sát chỉ tiêu này làm cơ sở xây dựng quy trình lên men tốt nhất cho vi khuẩn P.multocida chủng N41.
Chúng tơi đã tiến hành khảo sát một số mẻ lên men ñược thực hiện với các mức DO
khác nhau là 40%, 60%, 70%, 80%, 90%. Lấy mẫu xác ñịnh ñậm ñộ vi khuẩn tại 4 thời
ñiểm trong q trình lên men để đánh giá tốc độ tăng sinh của vi khuẩn và xác định thời
điểm thích hợp ñể dừng lên men.
ðối với hệ thống lên men tự ñộng Bioflọ5000 (New Brunswich) việc thiết lập chế ñộ ổn ñịnh mức DO khá dễ dàng và thuận lợi bằng việc bổ sung O2 từ bình O2 thơng qua
van từ tự động, Ngồi ra, việc điều chỉnh mức DO cịn được thực hiện thơng qua chế ñộ
tăng giảm tốc ñộ khuấy của ñộng cơ khuấy và điều chỉnh lưu tốc cấp khí vào bình thơng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 42 tôi thực hiện khá dễ dàng.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần đối với mỗi mức DO, các điều kiện ni cấy khác ñược ñảm bảo giống nhau ở tất cả các mẻ lên men. Kết quả được trình bày tại bảng 3.04.
Sự biến ñộng ñậm ñộ vi khuẩn trong q trình sinh khối tại các thời điểm và các mức DO
khác nhau ñược thể hiện qua biểu ñồ tại hình 3.02:
Bảng 3.04. Ảnh hưởng của hàm lượng DO ñến ñậm ñộ vi khuẩn
ðậm ñộ vi khuẩn (x109CFU/ml)
DO (%)
5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ
40 11,0 ± 0,82 15,5 ± 0,66 21,5 ± 0,81 22,0 ± 0,50
60 13,5 ± 0,50 17,0 ± 0,81 26,5 ± 0,50 28,0 ± 0,50
70 12,0 ± 0, 66 23,5 ± 0,66 28,5 ± 0,66 28,5 ± 0,50
80 11,0 ± 0,00 22,0 ± 0,66 30,5 ± 0,87 28,0 ± 1,05
90 10,5 ± 0,66 18,5 ± 0,61 26,0 ± 0,82 26,5 ± 0,50
Hình 3.02. Biến động đậm độ vi khuẩn tại các mức DO theo thời gian
Qua bảng 3.04 và biểu đồ hình 3.02 chúng tơi nhận thấy, ñậm ñộ vi khuẩn sau lên men ñạt cao nhất ở mức DO 80% là (30,5 ± 0,87) x 109 CFU/ml canh khuẩn, tại thời
ñiểm lấy mẫu 7 giờ sau khi truyền giống, 1 giờ sau đó đậm độ vi khuẩn giảm đi cịn (28,0
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 43 thuận với mức tăng DO cũng như theo thời gian nuôi cấỵ Tuy nhiên với mức DO vượt quá 80% thì hiệu quả ni cấy giảm đi rõ rệt. ðiều này có thể được giải thích rằng
P.multocida là dạng vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí khơng bắt buộc, nhu cầu sử dụng O2
không quá cao và khác nhau ở các giai đoạn phát triển, bên cạnh đó cịn phụ thuộc vào
điều kiện dinh dưỡng của mơi trường trong từng thời điểm ni cấy ni cấỵ
Quan sát q trình lên men chúng tơi cũng nhận thấy rằng vi khuẩn P.multocida N41 phát triển, tăng sinh mạnh nhất về số lượng là sau 5-7 giờ ni cấy, đây là khoảng thời gian thể hiện sự trao ñổi chất mạnh mẽ, biểu hiện qua sự biến đổi màu sắc mơi trường, sự thay đổi độ pH của mơi trường, mức ñộ sử dụng O2 cao… Tại thời ñiểm lấy mẫu 8 giờ
ni cấy mật độ vi khuẩn giảm đi hoặc tăng lên khơng rõ rệt so với thời điểm 7 giờ. ðiều này có thể được giải thích rằng, khi mật độ vi khuẩn tăng lên thì hàm lượng ñộc tố trong môi trường nuôi cấy cũng tăng lên. ðồng thời, giá trị dinh dưỡng của môi trường giảm ñi,
khả năng tái sinh của tế bào vi khuẩn giảm sút, tế bào già chết dần. Do đó mật ñộ vi
khuẩn xác ñịnh bằng phương pháp ñếm số khuẩn lạc sẽ giảm ñi tất yếụ
Qua kết quả khảo sát chúng tơi nhận định: Hàm lượng DO có ảnh hưởng khá rõ đến khả năng cũng như tốc ñộ tăng sinh của vi khuẩn P.multocida chủng N41. Mức DO phù hợp nhất để ni cấy vi khuẩn P.multocida chủng N41 là 80%, thời ñiểm kết thúc lên men tốt nhất là sau 7 giờ và không quá 8 giờ ni cấỵ
Theo quy trình sản xuất vắc xin bất hoạt bắt buộc ñối với P.multocida Ngay sau khi quá trình lên men kết thúc P.multocida N41 phải ñược bất hoạt bằng Formaldehyte với nồng ñộ 0,3% thể tích canh khuẩn, ở điều kiện nhiệt độ 370C, trong 48 - 72 giờ. Tiến hành kiểm tra vô trùng trước khi sử dụng ñể chế văc xin. Số lượng tế bào P.multocida N41 cần
có trong 1ml văc xin phải đạt 10x109 tế bào ở tất cả các lơ sản xuất.