C Khả năng gây bệnh cho gà trên 2 tháng tuổi 1 LD50 180 ñơn vị khuẩn lạc
3 Tái phân lập vi khuẩn từ
3.2.2. Xác ñịnh hàm lượng oxy hòa tan (DO) tối ưu
Lên men sục khí sinh học ñược xem là giải pháp công nghệ tiên tiến trong sản xuất văc xin vi trùng. Công nghệ này cho phép chúng ta nâng cao ñậm ñộ vi khuẩn khi nuôi cấy sinh khối, tăng hàm lượng kháng nguyên trong một ñơn vị thể tích văc xin, từñó giảm liều tiêm cũng như hạ giá thành/liều văc xin. Quá trình lên men sục khí ñược thực hiện trên hệ thống thiết bị hoàn toàn tựñộng trong việc ñảm bảo các ñiều kiện nuôi cấy như: nhiệt ñộ, ñộ pH, hàm lượng O2 hòa tan (DO)…
ðiều kiện nuôi cấy phù hợp nhất ñối với P.multocida là ở nhiệt ñộ 370C và pH 7,20. Hàm lượng O2 hòa tan (DO) tối ưu là một chỉ tiêu chưa ñược xác ñịnh. Do ñó, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu nhằm khảo sát chỉ tiêu này làm cơ sở xây dựng quy trình lên men tốt nhất cho vi khuẩn P.multocida chủng N41.
Chúng tôi ñã tiến hành khảo sát một số mẻ lên men ñược thực hiện với các mức DO khác nhau là 40%, 60%, 70%, 80%, 90%. Lấy mẫu xác ñịnh ñậm ñộ vi khuẩn tại 4 thời
ñiểm trong quá trình lên men ñểñánh giá tốc ñộ tăng sinh của vi khuẩn và xác ñịnh thời
ñiểm thích hợp ñể dừng lên men.
ðối với hệ thống lên men tựñộng Bioflọ5000 (New Brunswich) việc thiết lập chế ñộổn ñịnh mức DO khá dễ dàng và thuận lợi bằng việc bổ sung O2 từ bình O2 thông qua van từ tựñộng, Ngoài ra, việc ñiều chỉnh mức DO còn ñược thực hiện thông qua chếñộ
tăng giảm tốc ñộ khuấy của ñộng cơ khuấy và ñiều chỉnh lưu tốc cấp khí vào bình thông qua hệ thống van từ. Chính vì thế, việc ổn ñịnh mức DO trong các thử nghiệm của chúng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 42 tôi thực hiện khá dễ dàng.
Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần ñối với mỗi mức DO, các ñiều kiện nuôi cấy khác
ñược ñảm bảo giống nhau ở tất cả các mẻ lên men. Kết quảñược trình bày tại bảng 3.04. Sự biến ñộng ñậm ñộ vi khuẩn trong quá trình sinh khối tại các thời ñiểm và các mức DO khác nhau ñược thể hiện qua biểu ñồ tại hình 3.02:
Bảng 3.04. Ảnh hưởng của hàm lượng DO ñến ñậm ñộ vi khuẩn
ðậm ñộ vi khuẩn (x109CFU/ml) DO (%) 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 40 11,0 ± 0,82 15,5 ± 0,66 21,5 ± 0,81 22,0 ± 0,50 60 13,5 ± 0,50 17,0 ± 0,81 26,5 ± 0,50 28,0 ± 0,50 70 12,0 ± 0, 66 23,5 ± 0,66 28,5 ± 0,66 28,5 ± 0,50 80 11,0 ± 0,00 22,0 ± 0,66 30,5 ± 0,87 28,0 ± 1,05 90 10,5 ± 0,66 18,5 ± 0,61 26,0 ± 0,82 26,5 ± 0,50
Hình 3.02. Biến ñộng ñậm ñộ vi khuẩn tại các mức DO theo thời gian
Qua bảng 3.04 và biểu ñồ hình 3.02 chúng tôi nhận thấy, ñậm ñộ vi khuẩn sau lên men ñạt cao nhất ở mức DO 80% là (30,5 ± 0,87) x 109 CFU/ml canh khuẩn, tại thời
ñiểm lấy mẫu 7 giờ sau khi truyền giống, 1 giờ sau ñó ñậm ñộ vi khuẩn giảm ñi còn (28,0 ± 1,05)x109 CFU/ml canh khuẩn. Nhìn chung ñậm ñộ vi khuẩn ñược tăng dần lên tỷ lệ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 43 thuận với mức tăng DO cũng như theo thời gian nuôi cấỵ Tuy nhiên với mức DO vượt quá 80% thì hiệu quả nuôi cấy giảm ñi rõ rệt. ðiều này có thể ñược giải thích rằng
P.multocida là dạng vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí không bắt buộc, nhu cầu sử dụng O2 không quá cao và khác nhau ở các giai ñoạn phát triển, bên cạnh ñó còn phụ thuộc vào
ñiều kiện dinh dưỡng của môi trường trong từng thời ñiểm nuôi cấy nuôi cấỵ
Quan sát quá trình lên men chúng tôi cũng nhận thấy rằng vi khuẩn P.multocida N41
phát triển, tăng sinh mạnh nhất về số lượng là sau 5-7 giờ nuôi cấy, ñây là khoảng thời gian thể hiện sự trao ñổi chất mạnh mẽ, biểu hiện qua sự biến ñổi màu sắc môi trường, sự
thay ñổi ñộ pH của môi trường, mức ñộ sử dụng O2 cao… Tại thời ñiểm lấy mẫu 8 giờ
nuôi cấy mật ñộ vi khuẩn giảm ñi hoặc tăng lên không rõ rệt so với thời ñiểm 7 giờ. ðiều này có thểñược giải thích rằng, khi mật ñộ vi khuẩn tăng lên thì hàm lượng ñộc tố trong môi trường nuôi cấy cũng tăng lên. ðồng thời, giá trị dinh dưỡng của môi trường giảm ñi, khả năng tái sinh của tế bào vi khuẩn giảm sút, tế bào già chết dần. Do ñó mật ñộ vi khuẩn xác ñịnh bằng phương pháp ñếm số khuẩn lạc sẽ giảm ñi tất yếụ
Qua kết quả khảo sát chúng tôi nhận ñịnh: Hàm lượng DO có ảnh hưởng khá rõ ñến khả năng cũng như tốc ñộ tăng sinh của vi khuẩn P.multocida chủng N41. Mức DO phù hợp nhất ñể nuôi cấy vi khuẩn P.multocida chủng N41 là 80%, thời ñiểm kết thúc lên men tốt nhất là sau 7 giờ và không quá 8 giờ nuôi cấỵ
Theo quy trình sản xuất vắc xin bất hoạt bắt buộc ñối với P.multocida Ngay sau khi quá trình lên men kết thúc P.multocida N41 phải ñược bất hoạt bằng Formaldehyte với nồng ñộ 0,3% thể tích canh khuẩn, ởñiều kiện nhiệt ñộ 370C, trong 48 - 72 giờ. Tiến hành kiểm tra vô trùng trước khi sử dụng ñể chế văc xin. Số lượng tế bào P.multocida N41 cần có trong 1ml văc xin phải ñạt 10x109 tế bào ở tất cả các lô sản xuất.