* Khảo sát điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội vùng xây dựng mô hình
* Thiết kế tổng thể mô hình trình diễn gồm v−ờn −ơm - khu trồng thử nghiệm và khu ch−ng cất tinh dầu.
* Điều tra sinh hoá học vùng Tràm tự nhiên ở địa phương, định hướng sử dụng tinh dầu.
* Sản xuất cây giống bằng ph−ơng pháp hữu tính và vô tính.
2.5.1- Ph−ơng pháp nhân giống
* Nhân giống hữu tính (ứng dụng với Bạch đàn chanh, Tràm và Sả hoa hồng) - Ph−ơng pháp nghiên cứu sự nẩy mầm của hạt:
+ Xác định trọng lượng hạt bằng phương pháp cân 1000 hạt trên cân phân tích điện tử với 3 lần nhắc lại tại phòng thí nghiệm Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên.
+ Xác định thời gian và tỷ lệ nẩy mầm của hạt trong điều kiện giấy lọc ngập nước đặt trong tủ ẩm (ở các nhiệt độ 25, 30 và 350C), nhắc lại 3 lần.
+ Xác định thời gian và tỷ lệ nảy mầm của hạt trong điều kiện ngoài vườn ươm của đề tài KC.09.21 (xã Thạch Hải, huyện Thạch Hà, Tỉnh Hà Tĩnh). Gieo hạt trong các bể xi măng có hệ thống bơm n−ớc. Nền giá thể gieo hạt là cát ẩm (độ ẩm khoảng 70%), cát ngập nước và đất ngập nước. Tại thời
điểm thí nghiệm ở 2 nơi có nhiệt độ trong khoảng 23 - 280C.
- Thời gian tiến hành thí nghiệm 2 năm (2004-2005)
* Ươm cây: - Khi hạt nứt nanh cho vào bầu đất pha cát có bổ xung phân hữu cơ. Kích th−ớc bầu: d = 10cm, h = 12cm
- Đặt bầu vào bể xi măng, dùng khung l−ới che m−a gió và nắng to.
- Trước khi đưa trồng phải đảo bầu
* Nhân giống vô tính ( ứng dụng với tràm lá hẹp và sả chanh ấn độ) Ph−ơng pháp chiết cành
Trên những cây tràm lá hẹp trồng bằng hạt tại Hà Nội chọn những cành có đường kính từ 0,5 đến 1cm, cành dài 50 - 60cm ở các vị trí khác nhau của cây: tầng dưới cùng, tầng giữa và tầng gần đỉnh cây. Tiến hành cắt bỏ một khoanh vỏ dài 3cm và xử lý với các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ:
- α-NAA (axit α-naphtyl axetic), IAA (axit β-indol axetic) đ−ợc sử dụng ở các nồng độ: 100, 200, 500 và 1000 ppm.
- ABT1 đ−ợc sử dụng ở các nồng độ 200, 500, 1000, 1500 và 2000 ppm.
Các dung dịch điều hoà sinh tr−ởng đ−ợc tẩm vào bông thấm n−ớc và xử lý lên vết cắt đã bóc vỏ. Cành chiết đ−ợc bó bằng đất trộn rơm hoặc rễ bèo mục thành bầu bên ngoài bầu bọc kín bằng polyetylen.
* Ph−ơng pháp giâm hom
- Giống gốc đ−ợc lấy ở Mai Châu (Hoà Bình), ở độ tuổi 2 – 3 năm. Chọn sả tép nhỏ, đanh cây, không sâu bệnh. Kinh nghiệm cho thấy những tép sả nhỏ phát triển nhanh, tuổi thọ kéo dài, tỷ lệ chết thấp. Đối với sả non 1-2 tuổi, tép to nh−ng tỷ lệ sống thấp hơn.
- Xử lý tép: bóc bớt lá khô, chặt ngắn thân cách gốc 7-10 cm, chặt bớt rễ, bó lại thành bó, mỗi bó 50-80 tép xử lý thuốc diệt nấm. Sau đó đem hồ rễ bằng hỗn hợp bùn −ớt 50% + phân chuồng hoại, lân 50% + 1% đạm urê, hồ xong đem dàn thành hàng vào chỗ dâm, ẩm −ớt, t−ới gốc (tránh t−ới lên thân lá), giữ ẩm, để 3-4 ngày rễ trắng bắt đầu nhú thì trồng ra.
2.5.2: Ph−ơng pháp nghiên cứu động thái sinh tr−ởng của cây + Chiều cao cây, đừng kính thân, kích thước tán
Định kỳ đo vào ngày 20 hàng tháng từ năm 2004 - 2005 trên 30 cá thể (đối với cây trồng bằng hạt) và trên 30 cá thể (đối với cây trồng bằng cành chiết) tại các điểm thí nghiệm.
- Chiều cao cây (chiều cao vút ngọn): dùng th−ớc gỗ có chiều dài 2m,
đ−ợc chia tới mm, đo từ gốc sát mặt đất tới lá cuối cùng của ngọn cây.
- Đ−ờng kính thân: dùng th−ớc kẹp (panme) có du xích 0,01 mm đo tại
điểm cách mặt đất 10 cm.
- Đường kính tán: dùng thước gỗ (như trên) đặt theo đường chéo vuông góc qua thân tại điểm có cành lớn nhất tới vút ngọn cành.
+ Theo dõi đặc tính tích lũy chất xanh
Đặc tính tích lũy chất xanh được xác định qua các thời kỳ sinh trưởng (sau trồng 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng, 20 tháng và theo các mùa trong năm…). Cân tại chỗ trọng l−ợng toàn bộ cành con mang lá của từng cá thể trên cân đĩa (có độ chính xác tới 1g). Mỗi mẫu xác định đ−ợc nhắc lại 3 lần.
2.5.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu ảnh h−ởng của thổ nh−ỡng và kỹ thuật canh tác lên động thái sinh tr−ởng của cây
- Trồng thử nghiệm Bạch đàn chanh, Tràm, Sả chanh ấn Độ và Sả hoa hồng trên cát (1500m2 trong v−ờn −ơm, 1000 m2 v−ờn thử nghiệm của Hội Liên hiệp phụ nữ xã Thạch Hải và 1000 m2 của hộ nông dân).
- Trồng thử nghiệm Sả chanh ấn Độ trên đất đồi đá ong (1000 m2 xã
Ngọc Sơn).
- Trồng thử nghiệm Bạch đàn chanh trên cát 500 m2 trong vườn ươm, trồng “chay” (không bón phân). 20.000 m2 (hộ nông dân), không đánh luống, có bón phân, 20.000 m2 (hộ nông dân), có đánh luống, có bón phân
- Trồng thử nghiệm Tràm, Bạch đàn chanh trên đất ngập mặn tại bể thí nghiệm ở vườn ươm (bể 3 ngăn chứa 1/4 thể tích đất mặn ở vùng cửa sông, đổ thêm nước biển pha loãng đến nồng độ 1‰, 15‰ và 20‰ đến ngập đất 10 cm) và ruộng phèn mặn khô hạn mùa hè và ngập n−ớc mùa lũ ở xã Thạch Đỉnh (500 m2).
- Trồng thử nghiệm Bạch đàn chanh trên đất đồi đá ong (10.000 m2 xã
Ngọc Sơn) và đất thịt (Hà Nội).
- Đánh giá khả năng thích nghi của các loại cây trồng thông qua động thái sinh tr−ởng của cây bằng ph−ơng pháp trình bày ở mục 2.4.2.
2.5.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu động thái tích lũy tinh dầu
* Ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng tinh dầu
Xác định hàm lượng tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước hồi lưu: cho 100g lá tươi (ngay sau khi thu hái) vào một bình cầu dung tích 2000 ml, thêm nước cất đến ngập nguyên liệu. Bình cầu này được lắp ráp với bộ tách dầu - nước có ống hứng chia độ găn với một sinh hàn hồi lưu. Đun bình cầu trên bếp điện có lưới chịu nhiệt amiant cho đến khi không còn tinh dầu được tạo ra thêm trong ống chia độ của bộ tách dầu - nước. Quy trình này
được lặp lại 5 lần (500g nguyên liệu tưới). Định kỳ lấy mẫu lá hàng tháng để theo dõi động thái tích lũy tinh dầu.
* Xác định hàm l−ợng n−ớc
Xác định nước trong lá tươi (để xác định hàm lượng tinh dầu trong lá
khô tuyệt đối) theo phương pháp cất với dung môi: cần chính xác 10g lá tươi (ngay sau khi thu hái) vào bình cầu dung tích 500 ml đã sấy khô, cho thêm 100 ml xylen hoặc toluen và vài hạt đá bọt. Bình cầu này đ−ợc lắp ráp với ống đo nước chia độ tới 1/10 ml gắn với một sinh hàn hồi lưu. Đun bình cầu trên bếp
điện cho đến khi đường phân chia giữa hai lớp nước và dung môi không thay
đổi. Nếu có những giọt nước còn đọng trên ống sinh hàn thì dùng 5 ml dung môi để đẩy xuống. Đọc thể tích nước hứng được và tính tỷ lệ phần trăm nước trong nguyên liệu lấy giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm nhắc lại. Từ đó tính đ−ợc hàm l−ợng tinh dầu trong lá khô tuyệt đối.
Tinh dầu đ−ợc làm khô bằng Na2SO4 khan và cất giữ trong lọ kín ở nhiệt
độ thấp (5-100C) trước khi phân tích.
* Xác định các chỉ số vật lý của tinh dầu
- Tỷ trọng được xác định bằng phương pháp picnomet.
- Chỉ số khúc xạ đo trên máy khúc xạ kế AR-8 (hãng A-Kruss Optronic).
- Năng suất quay cực đ−ợc đo trên máy Electronic Polarimeter P.3001 (hãng A-Kruss Optronic).
* Phân tích thành phần hoá học của tinh dầu:
Sử dụng ph−ơng pháp GC/MS trên máy sắc ký khí HP 6890 (Mỹ) nối ghép với Detector khối phổ Agilent 5973 (Mỹ).
Điều kiện tiến hành:
Cột mao quản HP5-MS (30m x 0.32mm x 0.25àm), khí mang He; tốc
độ dòng 1ml/min; nhiệt độ buồng hơi 260O, chế độ nhiệt 60O (2min) 4O/min 180O (3min) 20O/min 260O; khoảng quét 30-360. Cấu trúc các thành phần tinh dầu đ−ợc xác định trên cơ sở so sánh với th− viện phổ khối WILEY 275 và NIST 98.
* Xác định hàm l−ợng và thành phần tinh dầu trong các bộ phận lá, cành, vỏ, rễ… bằng GC/MS.
* Theo dõi biến động hàm l−ợng, chất l−ợng tinh dầu trong quá trình sinh tr−ởng và phát triển của cây.
- Định kỳ thu mẫu hàng tháng, xác định hàm l−ợng tinh dầu.
- Phân tích tinh dầu bằng GC/MS.
* Khảo sát biến dị sinh hoá học trong quần chủng loài
* Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp toán học thống kê trên máy tính theo ch−ơng trình Excel 97 trên cơ sở các công thức toán học:
- Lấy mẫu bình quân số học:
- Dùng độ lệch bình phương trung bình để thể hiện mức độ sai lệch so với trị số trị số bình quân của những tập hợp riêng lẻ:
∑=
=
+ = + +
= + i n
i
n x
n n
x ....
x x M x
1 3 1
2
1 1
∑= −
− = + +
− +
= 1− 2 2 2 2 1 1 2
2 ( ) ( ) ...(n ) 1 i ( )
M M x
x M
x M δ x