* Khảo sát điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội vùng xây dựng mô hình
* Thiết kế tổng thể mô hình trình diễn gồm v−ờn −ơm - khu trồng thử nghiệm và khu ch−ng cất tinh dầu.
* Điều tra sinh hoá học vùng Tràm tự nhiên ở địa phương, định hướng sử dông tinh dÇu.
* Sản xuất cây giống bằng ph−ơng pháp hữu tính và vô tính.
2.5.1. Ph−ơng pháp nhân giống
* Nhân giống hữu tính (ứng dụng với Bạch đàn chanh, Tràm và Sả hoa hồng)
* Nhân giống vô tính
- Ph−ơng pháp chiết cành ứng dụng với tràm lá hẹp - Phương pháp giâm ứng dụng với sả chanh ấn độ
2.5.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu động thái sinh tr−ởng của cây + Chiều cao cây, đừng kính thân, kích thước tán
Định kỳ đo vào ngày 20 hàng tháng từ năm 2004 - 2005 trên 30 cá thể (đối với cây trồng bằng hạt) và trên 30 cá thể (đối với cây trồng bằng cành chiết) tại các điểm thí nghiệm.
- Chiều cao cây (chiều cao vút ngọn): dùng th−ớc gỗ có chiều dài 2m,
đ−ợc chia tới mm, đo từ gốc sát mặt đất tới lá cuối cùng của ngọn cây.
- Đ−ờng kính thân: dùng th−ớc kẹp (panme) có du xích 0,01 mm đo tại
điểm cách mặt đất 10 cm.
- Đường kính tán: dùng thước gỗ (như trên) đặt theo đường chéo vuông góc qua thân tại điểm có cành lớn nhất tới vút ngọn cành.
+ Theo dõi đặc tính tích lũy chất xanh
Đặc tính tích lũy chất xanh được xác định qua các thời kỳ sinh trưởng (sau trồng 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng, 20 tháng và theo các mùa trong năm…). Cân tại chỗ trọng l−ợng toàn bộ cành con mang lá của từng cá thể trên cân đĩa (có độ chính xác tới 1g). Mỗi mẫu xác định đ−ợc nhắc lại 3 lần.
2.5.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu ảnh h−ởng của thổ nh−ỡng và kỹ thuật canh tác lên động thái sinh tr−ởng của cây
- Trồng thử nghiệm Bạch đàn chanh, Tràm, Sả chanh ấn Độ và Sả hoa hồng trên cát (1500m2 trong v−ờn −ơm, 1000 m2 v−ờn thử nghiệm của Hội Liên hiệp phụ nữ xã Thạch Hải và 1000 m2 của hộ nông dân).
- Trồng thử nghiệm Sả chanh ấn Độ trên đất đồi đá ong (1000 m2 xã Ngọc Sơn).
- Trồng thử nghiệm Bạch đàn chanh trên cát 500 m2 trong vườn ươm, trồng “chay” (không bón phân). 20.000 m2 (hộ nông dân), không đánh luống, có bón phân, 20.000 m2 (hộ nông dân), có đánh luống, có bón phân
- Trồng thử nghiệm Tràm, Bạch đàn chanh trên đất ngập mặn tại bể thí nghiệm ở vườn ươm (bể 3 ngăn chứa 1/4 thể tích đất mặn ở vùng cửa sông, đổ thêm nước biển pha loãng đến nồng độ 1‰, 15‰ và 20‰ đến ngập đất 10 cm) và ruộng phèn mặn khô hạn mùa hè và ngập n−ớc mùa lũ ở xã Thạch Đỉnh (500 m2).
- Trồng thử nghiệm Bạch đàn chanh trên đất đồi đá ong (10.000 m2 xã
Ngọc Sơn) và đất thịt (Hà Nội).
- Đánh giá khả năng thích nghi của các loại cây trồng thông qua động thái sinh tr−ởng của cây bằng ph−ơng pháp trình bày ở mục 2.4.2.
2.5.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu động thái tích lũy tinh dầu
- Xác định hàm lượng tinh dầu và hàm lượng nước bằng dụng cụ chuyên dụng - Phân tích thành phần hoá học và tinh dầu
* Xác định các chỉ số vật lý của tinh dầu
- Tỷ trọng được xác định bằng phương pháp picnomet.
- Chỉ số khúc xạ đo trên máy khúc xạ kế AR-8 (hãng A-Kruss Optronic).
- Năng suất quay cực đ−ợc đo trên máy Electronic Polarimeter P.3001 (hãng A-Kruss Optronic).
* Phân tích thành phần hoá học của tinh dầu:
Sử dụng ph−ơng pháp GC/MS trên máy sắc ký khí HP 6890 (Mỹ) nối ghép với Detector khối phổ Agilent 5973 (Mỹ).
Điều kiện tiến hành:
Cột mao quản HP5-MS (30m x 0.32mm x 0.25àm), khí mang He; tốc độ dòng 1ml/min; nhiệt độ buồng hơi 260O, chế độ nhiệt 60O (2min) 4O/min 180O (3min) 20O/min 260O; khoảng quét 30-360. Cấu trúc các thành phần tinh dầu
đ−ợc xác định trên cơ sở so sánh với th− viện phổ khối WILEY 275 và NIST 98.
* Xác định hàm l−ợng và thành phần tinh dầu trong các bộ phận lá, cành, vỏ, rễ… bằng GC/MS.
* Theo dõi biến động hàm l−ợng, chất l−ợng tinh dầu trong quá trình sinh tr−ởng và phát triển của cây.
- Định kỳ thu mẫu hàng tháng, xác định hàm l−ợng tinh dầu.
- Phân tích tinh dầu bằng GC/MS.
* Khảo sát biến dị sinh hoá học trong quần chủng loài
* Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp toán học thống kê trên máy tính theo ch−ơng trình Excel 97 trên cơ sở các công thức toán học:
- Lấy mẫu bình quân số học:
- Dùng độ lệch bình phương trung bình để thể hiện mức độ sai lệch so với trị số trị số bình quân của những tập hợp riêng lẻ:
2.6. Ph−ơng pháp nghiên cứu xây dựng chế phẩm dinh d−ỡng Nufid
* Quy trình điều chế hỗn hợp axit amin từ vẹm xanh ( BD1)
Nguyên liệu đông lạnh sau khi làm tan đá ngoài trời ở nhiệt độ lớn hơn 200C đ−ợc tách vỏ, lấy phần mô mềm đem nghiền nhỏ. Chiết bằng cồn etylic 50% theo tỷ lệ trọng l−ợng là 1/5 trong 24 giờ ở chế độ khuấy gián đoạn. Lọc bằng máy ép khung bản hoặc qua túi vải thô hai lớp ở áp suất 0.2 at. Loại cồn bằng máy cất quay. Dung dịch nước đuợc đem thăng hoa bằng thiết bị đông cô.
Sản phẩm đ−ợc sấy tiếp ở 23-270Ccho tới khi hàm l−ợng n−ớc không v−ợt quá
10% và được bảo quản ở 10-200C, độ ẩm không khí dưới 80%.
* Tách hỗn hợp axit amin và protein từ đậu t−ơng.
Ngâm đậu t−ơng trong n−ớc ấm (~ 500C) trong 30 phút. Xát vỏ, xay nhuyễn và lọc thu phần nước, điều chỉnh pH ~ 4 để tủa protein. Lọc và rửa tủa tới trung tính m, sấy khô ở 600C rồi tán thành bột mịn.
* Tách polyphenol từ đậu t−ơng theo ph−ơng pháp Tali và chiết carotenoit từ carot bằng cồn 450. Sau khi loại dung môi và cô đặc nhận đ−ợc phân đạm giàu polyphenol và cao carotenoit.
* Điều chế hỗn hợp giàu cholin và muối phylat canxi từ khoai lang.
Ngâm khoai lang trong nước vôi 1 giờ. Cắt lát nhỏ, sấy đến khô rồi sao chín và xay thành bột mịn. Ngâm bột trong dung dịch HCl 1N trong 5 giờ thu
∑=
=
+ = + +
= + i n
i
n x
n n
x ....
x x M x
1 3 1
2
1 1
∑=
=
− −
− =
− + +
− +
= − 1
1 1 2 2
2 2 1 2
2 ( )
1 1 1
) ( ...
) ( )
( i
i
n x M
n n
M x M
x M δ x
đ−ợc sản phẩm thô dạng keo màu vàng nhạt. Sau khi tinh chế lại cho hỗn hợp giàu cholin và phylat canxi.
* Phối trộn các thành phần theo tỷ lệ cho hoạt tính sinh học in vivo tốt nhất.
* Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở.
2.7. Các ph−ơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro a. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật bằng các phương pháp khoanh giấy lọc đặt trên bề mặt thạch theo d−ợc điển Việt Nam III và trên phiến vi l−ợng 96 giếng của các mẫu chiết theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) theo 2 b−ớc; b−ớc 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính; b−ớc 2: tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
Kháng vi sinh vật kiểm định bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn Gr(+).
Tetracylin đối với vi khuẩn Gr(-), Nystatin đối với nấm sợi và Amphotericine B cho nấm men. Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
Vi khuÈn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Vi khuÈn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus (ATCC 12222) NÊm mèc: Aspergillus niger 439
Fusarium oxysporum LM42
NÊm men: Saccharomyces cerevisiae (ATCC7754) Candida albicans SH20
-Đọc kết quả:
Nồng độ dương tính là ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU<5. Mẫu thô có MIC ≤ 200àg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50àg/ml là có hoạt tính.
b. Hoạt tính kháng Monoamin oxidase (Mao)
Hoạt tính của MAO trong phản ứng chuyển hóa kynuramin thành 4- hyđroxyquinolin (đề amin hoá theo cơ chế oxi hoá thành nhóm - OH phát huỳnh quang) đ−ợc tiến hành thử nghiệm theo ph−ơng pháp của Kram và Naoi có cải tiÕn.
+ Hoạt tính kháng MAO đ−ợc đánh giá theo công thức sau:
Amẫu đo – Amẫu trắng
Khả năng ức chế (%) = 1 - --- x 100 Amẫu kiểm tra – Amẫu trắng
Trong đó:
A mẫu đo: Cường độ huỳnh quang của mẫu thử
Amẫu trắng: Cường độ huỳnh quang của mẫu trắng Amẫu kiểm tra : Cường độ huỳnh quang của mẫu kiểm tra 2.8. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn 2.8.1. Ph−ơng pháp nghiên cứu độc tính cấp:
Theo ph−ơng pháp nghiên cứu của Turner.A (1965).
Theo Quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 về xác định độ an toàn cho các chề phẩm có nguồn gốc thiên nhiên của Bộ Y tế (1996)
+ Tính toán: theo ph−ơng pháp cải tiến của Livschitz P.Z (1986) theo công thức sau:
Trong đó: n : số động vật sử dụng trong từng nhóm thí nghiệm k : số nhóm động vật (cũng là mức liều thuốc)
mi : số động vật chết đếm đ−ợc theo từng nhóm trong 72h d : khoảng cách giữa các mức liều
xi : liều độ thuốc ở mức liều cao nhất zi :số lẻ tính từ công thức zi = 2k-1-2i ( i lấy các giá trị từ 1,2,3…., k-1)
2.8.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu độc tính bán tr−ờng diễn (cho động vật dùng thuèc tr−êng diÔn liÒu thÊp).
Phương pháp được mô tả bởi Abraham (1978) và theo quy định của WHO và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn thuốc trong nghiên cứu thuốc có nguồn gốc tự nhiên (Bộ Y tế, 1996; WHO 1993).
* Nghiên cứu độc tính bán trường diễn BD1 và NUFID trên thỏ:
Thỏ thí nghiệm đuợc chia làm các nhóm, nhóm chứng uống n−ớc muối sinh lý NaCl 0,9% 1ml/kg TLCT, nhóm dùng BD1 liều 0,4g/kg TLCT và nhóm dùng NUFID liều 1g/kg TLCT liên tục trong 4 tuần.
Theo dõi và ghi chép diễn biến thí nghiệm hàng ngày, hàng tuần cân thỏ,
điện tim, lấy máu vành tai thỏ làm các xét nghiệm huyết học và hoá sinh.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BD1 đối với tập tính động vật, trọng lượng cơ thể.
- Nghiên cứu ảnh h−ởng của BD1 và NUFID lên điện tim của thỏ.
- Nghiên cứu ảnh h−ởng của BD1 và NUFID lên các chỉ tiêu huyết học của thỏ (hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, tiểu cầu).
- Nghiên cứu ảnh h−ởng của BD1 và NUFID lên chức năng gan và thận của
i k i
k m
n d x d
LD ∑−
=
×
−
−
= 1
2
50 2