* Quy trình điều chế hỗn hợp axit amin từ vẹm xanh ( BD1)
Nguyên liệu đông lạnh sau khi làm tan đá ngoài trời ở nhiệt độ lớn hơn 200C đ−ợc tách vỏ, lấy phần mô mềm đem nghiền nhỏ. Chiết bằng cồn etylic 50% theo tỷ lệ trọng l−ợng là 1/5 trong 24 giờ ở chế độ khuấy gián đoạn. Lọc bằng máy ép khung bản hoặc qua túi vải thô hai lớp ở áp suất 0.2 at. Loại cồn bằng máy cất quay. Dung dịch nước đuợc đem thăng hoa bằng thiết bị đông cô. Sản phẩm đ−ợc sấy tiếp ở 23-270Ccho tới khi hàm l−ợng n−ớc không v−ợt quá 10% và được bảo quản ở 10-200C, độ ẩm không khí dưới 80%.
* Tách hỗn hợp axit amin và protein từ đậu t−ơng.
Ngâm đậu t−ơng trong n−ớc ấm (~ 500C) trong 30 phút. Xát vỏ, xay nhuyễn và lọc thu phần nước, điều chỉnh pH ~ 4 để tủa protein. Lọc và rửa tủa tới trung tính m, sấy khô ở 600C rồi tán thành bột mịn.
* Tách polyphenol từ đậu t−ơng theo ph−ơng pháp Tali và chiết carotenoit từ carot bằng cồn 450. Sau khi loại dung môi và cô đặc nhận đ−ợc phân đạm giàu polyphenol và cao carotenoit.
* Điều chế hỗn hợp giàu cholin và muối phylat canxi từ khoai lang.
Ngâm khoai lang trong nước vôi 1 giờ. Cắt lát nhỏ, sấy đến khô rồi sao chín và xay thành bột mịn. Ngâm bột trong dung dịch HCl 1N trong 5 giờ thu
đ−ợc sản phẩm thô dạng keo màu vàng nhạt. Sau khi tinh chế lại cho hỗn hợp giàu cholin và phylat canxi.
* Phối trộn các thành phần theo tỷ lệ cho hoạt tính sinh học in vivo tốt nhÊt.
* Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở.
2.7. Các ph−ơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro a. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật bằng các phương pháp khoanh giấy lọc đặt trên bề mặt thạch theo d−ợc điển Việt Nam III và trên phiến vi l−ợng 96 giếng của các mẫu chiết theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) theo 2 b−ớc; b−ớc 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính;
bước 2: tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
Kháng vi sinh vật kiểm định bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn Gr(+). Tetracylin đối với vi khuẩn Gr(-), Nystatin đối với nấm sợi và Amphotericine B cho nấm men. Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
Vi khuÈn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Vi khuÈn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus (ATCC 12222) NÊm mèc: Aspergillus niger 439
Fusarium oxysporum LM42
NÊm men: Saccharomyces cerevisiae (ATCC7754) Candida albicans SH20
* Các b−ớc tiến hành nh− sau:
B−ớc 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính Chuẩn bị vi sinh vật:
Nấm đ−ợc duy trì trong môi tr−ờng dinh d−ỡng: Saboraud dextrose broth. Vi khuẩn trong môi tr−ờng Trypcase soya broth (TBS). Các chủng kiểm
định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh d−ỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó đ−ợc pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bị mẫu thử:
- Hoà tan các tinh dầu trong dung dịch DMSO 100% bằng máy vortex với nồng độ 4mg/ml.
- Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi l−ợng 96 giếng, mỗi giếng 10àl mÉu.
- Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn 190àl vi sinh vật đã hoạt hoá.
- Đối chứng d−ơng:
Dãy 1: Môi tr−ờng
Dãy 2: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định
(Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha trong DMSO100% với nồng độ;
Ampixilin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0,04mM).
- Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật kiểm định
- Để trong tủ ấm 370C/24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm.
- Đọc kết quả:
Mẫu d−ơng tính nhìn bằng mắt th−ờng thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống nh− hình ảnh ở các giếng chứng âm tính.
Đối với ph−ơng pháp khoanh giấy lọc, mẫu đ−ợc hoà trong dung môi bay hơi với nồng độ 10 mg/ml, 200àl dung dịch tẩm vào khoanh giấy lọc, đợi khô, đặt lên bề mặt thạch đã trộn vi sinh vật, để tủ lạnh 3-5h cho chất khuyếch tán, ủ tủ ấm 370C/24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm; sau đó lấy ra đo vòng phân giải (nếu có) để có giá trị đường kính vòng vô khuẩn: D – d = Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC để so sánh kết quả.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính:
Các bước tiến hành như bước 1: Riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ
để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần nh− hoàn toàn.
-Đọc kết quả:
Nồng độ dương tính là ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU<5. Mẫu thô có MIC ≤ 200àg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50àg/ml là có hoạt tính.
b. Hoạt tính kháng Monoamin oxidase (Mao)
• Monoamine oxidase (MAO) là một loại enzim màng ty lạp thể ngoài
đ−ợc sản xuất ra trong não và biểu hiện cao nhất ở vỏ trán não và ở gen coeruleus. MAO xúc tác cho phản ứng đề amin hoá các chất dẫn truyền thần kinh nh− catecholamin, serotonin… và là một trong những tiền chất điều chế thuốc chữa bệnh trầm cảm. MAO tồn tại d−ới hai dạng: MAO-A và MAO-B do sự khác biệt trong phương thức lựa chọn cơ chất mà nó xúc tác, độ nhạy cảm ức chế và trật tự các amin trong cấu trúc phân tử. MAO-A đề amin hoá
chủ yếu các serotonin, norepinephrin, trong khi MAO-B lại oxi hoá β- phenylethylamin và benzylamin. Cả hai loại MAO đều có chứa trong não người, đặc biệt là ở vỏ não trước. Cho đến nay, cấu trúc không gian ba chiều của phân tử MAO vẫn ch−a đ−ợc làm sáng tỏ. Năm 1950, thế hệ đầu tiên các chất ức chế MAO đã đ−ợc đ−a vào thử nghiệm để chữa trị bệnh rối loạn trầm cảm. Các kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy chúng ức chế hội chứng trầm cảm rất tốt, hơn cả những thuốc chữa bệnh trầm cảm th−ờng dùng họ trixiclit.
Những năm gần đây, người ta đặc biệt chú ý đến MAO bởi hai lý do: một là, người ta đã phát hiện ra độc tố thần kinh 1- methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyrinid (MPTP) là nguyên nhân gây ra cái chết của các nơ-ron thần kinh gây tiết dopamin và làm giảm hội chứng Parkinson ở ng−ời; hai là, các chất ức chế MAO không gây các tác động phụ nh− tăng huyết áp, rối loạn nhịp
tim… Gần đây người ta dành nhiều sự quan tâm đến các chất ức chế MAO từ thực vật, đặc biệt từ những cây thuốc cổ truyền, là do khả năng chữa trị bệnh trầm cảm của chúng.
• Chuẩn bị enzym MAO từ chuột nhắt trắng:
Chuột nhắt trắng (con đực) giống ICR, cân nặng 25-30 g/con do Trung tâm động vật thí nghiệm Samyook (Tp. Suvon, Hàn Quốc) cung cấp. Các phân
đoạn ty lạp thể (tiểu thể) từ não chuột đ−ợc điều chế theo ph−ơng pháp của Naoi và được mô tả như sơ đồ dưới đây.
Hình 3: Sơ đồ điều chế MAO thô từ n∙o chuột
Hoạt tính của MAO trong phản ứng chuyển hóa kynuramin thành 4- hyđroxyquinolin (đề amin hoá theo cơ chế oxi hoá thành nhóm –OH phát huỳnh quang) đ−ợc tiến hành thử nghiệm theo ph−ơng pháp của Kram và Naoi có cải tiến. Dung dịch ức chế MAO: pha mẫu thử trong dung môi dimethylsulfosid (DMSO) theo tỷ lệ nồng độ 250 àg/ml. Sự phát huỳnh quang của 4-hyđroxyquinolin đ−ợc đo trên máy HITACHI F-3000 ở các b−ớc sóng 380 nm (phát xạ) và 315 nm (kích thích) (phản ứng để trắng, không có cơ
chÊt).
Hỗn hợp phản ứng gồm 73àl dung dịch đệm photphát 0,2 M (pH 7,4), 5àl enzim, 2àg dung dịch mẫu thử và 20 àl dung dịch kynuramin (cơ chất).
Lắc nhẹ hỗn hợp phản ứng trong vòng 30 phút, ổn nhiệt (trên bếp cách thuỷ) ở 8.8g não chuột trong 20ml dd đ−ờng