vitro
2.5.1. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị tinh dầu trích ly từ lá Cúc này đã pha loang với DMSO lần lượt với các nồng độ 0,25%, 0,5%, 0,75% và 1% nồng độ an toàn sử dụng. (Robert và Rodney, “esential oil safety”, 2014)
Chuẩn bị 4 loại vi khuẩn: Salmonella, Staphylococcus aureus, E. coli, Bacillus
cereus .
Tăng sinh Pha loãng
Đặt khoanh giấy tẩm tinh dầu và kháng sinh vào đĩa đã cấy vi sinh vật
Cấy vào đĩa compact dry
Ủ trong điều kiện thích hợp cho từng loại vi sinh vật trong 24 giờ
Mẫu đã được xử lý
Tinh dầu lá Cúc vàng, kháng sinh
Thấm vào giấy lọc với đường kính 6 mm
Đo kích thước vịng kháng khuẩn và chụp ảnh
Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh để đối chiếu (Ampicillin)
Cân chính xác 50 mg thuốc kháng sinh Ampicillin cần thử, hòa tan vào 50 ml nước cất, nếu thuốc khơng tan trong nước thì hịa tan với DMSO, ta sẽ được nồng độ dung dịch mẹ 1 mg/ml. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh.
2.5.2. Chuẩn bị môi trường
Thạch nền: sử dụng mơi trường NA, pha NA vào nước cất sau đó hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 50oC đến 60oC sau đó cấy trang vsv vào các đĩa petri đã tiệt trùng.
Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9 % hấp khử trùng 121oC, 1 atm, 15 phút.
2.5.3. Nguyên tắc
Các hợp chất kháng khuẩn có trong tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu tinh dầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vịng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng đường kính vịng kháng khuẩn (mm).
2.5.4. Tiến hành
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn:
Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng (NaCl 0,9 %), lắc đều.
Lấy tăm bông đã hấp tiệt trùng thấm vào huyền dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và đạt mật độ 106 – 108 cfu/ml lên mặt thạch NA và tiến hành cấy trang đều cho tới khơ. Sau đó đặt 3 đĩa kháng sinh đã có tinh dầu trầu khơng (đã pha lỗng theo từng nồng độ) và kháng sinh có đường kính 6 mm trên đĩa thạch, giữ n trong vịng 1 giờ để tinh dầu và kháng sinh ĐC có thể khuếch tán vào mơi trường thạch. Cuối cùng, các đĩa được đem ủ trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vịng ức chế (mm).
2.5.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch cùa Hadacek và cộng sự (2000). Theo đó, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo bán kính vịng ức chế vi sinh vật (BK) (bộ y tế, 2017) theo công thức:
BK (mm) = D – d
Trong đó: D: đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
d: đường kính khoanh giấy kháng (mm)
Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi sinh vật thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu diễn bằng đường kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
2.5.6. Phương pháp tính tốn
Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn thu được qua 3 lần thí nghiệm lặp lại tính trung bình
Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính vịng vơ khuẩn của (Celikel và Kavas, 2008):
− Đường kính vịng vơ khuẩn < 8 mm: khơng nhạy − Đường kính vịng vơ khuẩn từ 9 – 14 mm: nhạy − Đường kính vịng vơ khuẩn 15 – 19 mm: rất nhạy − Đường kính vịng vơ khuẩn > 20 mm: cực nhạy
2.6. Phương pháp thử nghiệm in vivo trên chuột
Hình 2.14. Quy trình kháng khuẩn in vivo của tinh dầu lá Cúc vàng trên chuột trắng mắt đỏ
2.6.1. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị sản phẩm từ tinh dầu từ lá Cúc được pha loãng ở nồng độ tối ưu với khả năng kháng khuẩn được khảo sát ở thí nghiệm kháng khuẩn với S.aureus.
Điều trị bằng băng gạt có tẩm tinh dầu
Làm sạch phần da cần khảo sát
Gây nhiễm khuẩn trên phần da đã được làm sạch
Quan sát biểu hiện trên da chuột
Chuột trắng mắt đỏ nuôi thuần
Chuột bạch được cung cấp bởi viện Pasteur với trọng lượng 18 – 20g , độ tuổi từ 3 – 4 tuần tuổi, phịng ni những chú chuột này ln phải đảm bảo duy trì nhiệt độ cố định là 25 - 26 độ C, độ ẩm 60 – 70 % bằng hệ thống điều hồ khơng khí.
Chuẩn bị vi khuẩn: Staphylococcus aureus.
2.6.2. Nguyên tắc
Theo tài liệu “thử nghiệm phi lâm sàn và lâm sàn thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” (Phạm Thanh Kỳ, 2015). Ni dưỡng và chăm sóc: động vật phải nuỗi giữ trong điều kiện mơi trường thí nghiệm, n tĩnh, thống khí, nhiệt độ từ 20 – 300C, độ ẩm 60 – 75%. Có đủ chuồng đề ni giữ động vật. Chuồng phải có kích thước phù hợp, có đủ chỗ để thức ăn, nước uống, thoáng, sạch sẽ, dễ làm vệ sinh. Những lồi nhỏ như chuột nhắt có thể ni nhốt theo từng nhóm tương ứng với các mức liều thử, động vật lớn cần nuôi giữ từng con. Động vật cần được lưu giữ trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 2 ngày (với động vật nhỏ) hoặc 5 ngày (với động vật lớn) trước khi thí nghiệm.
Tôn trọng giờ cho ăn hàng ngày để không ảnh hưởng đến hấp thụ thuốc và tránh sự căng quá mức của dạ dày. Thường cho uống thuốc vào sáng hôm sau tức là sau khoảng 16 giờ kể từ khi cho ăn bữa cuối cùng của ngày hôm trước .
Trọng lượng của động vật phải cân vào lúc đói, trước thí nghiệm. Nhận động vật thí nghiệm từ các nơi cung cấp, cân nặng cũng phải tính lúc đói.
2.6.3. Tiến hành
Nuôi thuần chuột bạch trong môi trường yên tĩnh, thống khí, nhiệt độ từ 20- 300C, độ ẩm 60 – 75%. Trong vòng 2 tuần.
Mật độ ni 3con/chuồng, có đủ thức ăn và nước uống, cho ăn 2 lần vào buổi sang
2.6.3.1. Thí nghiệm 1: khảo sát độ kích ứng với vết thưởng hở trên da chuột trắng mắt đỏ trắng mắt đỏ
Sau 2 tuần nuôi thuần chuột, làm sạch lông trên phần da trên phần lưng nằm trong khoảng cụt sọ đến khảng cụt đi chuột thí nghiệm, tạo vết thương hở dài khoảng 5 mm trên phần da đã được cạo lông.
Quan sát và ghi nhận kết quả trên da chuột trắng mắt đỏ đã được tạo vết thương hở và ghi lại kết quả.
Điều trị bằng sản phẩm có chứ tinh dầu lá Cúc vàng được pha lỗng với nồng độ thí hợp được sử dụng trên da với nồng độ tỏng khoảng 0,2 – 1,5%( Robert và Rodney, “esential oil safety”, 2014).
Khảo sát số lần sử dụng sản phẩm trên da chuột trắng mắt đỏ. 1 lần/ ngày, 2 lần/ ngày và 3 lần/ ngày. Quan sát và ghi nhật kết quả hồi phục vết thương hở của các nhóm chuột thí nghiệm trong 24h và 48h.
2.6.3.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tính kháng klhuẩn Staphylococcus aureus trên da chuột trắng mắt đỏ da chuột trắng mắt đỏ
Sau 2 tuần nuôi thuần chuột, làm sạch lông trên phần da trên phần lưng nằm trong khoảng cụt sọ đến khảng cụt đi chuột thí nghiệm, sau đó gây nhiễm S. aureus bằng cách bơi khuẩn trên bề mặt da đã được làm sạch và để 24h.
Quan sát biểu hiện trên phần da đã được gây nhiễm của chuột trắng mắt đỏ đã được gây nhiễm và ghi lại kết quả đối chứng.
Điều trị bằng sản phẩm có chứa tinh dầu lá Cúc vàng được pha với nồng độ thích hợp từ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn với S.aureus. Quan sát và ghi nhận kết quả sau 24h, 48h, 72h.
2.6.4. Thu thập và xử lý số liệu
Quan sát biểu hiện trên da chuột và ghi nhận. sau các mốc thời gian 12h, 24h, 48h, 72h.
2.7. Phương pháp thử nghiệm kích ứng trên thỏ