CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.6. Phương pháp thử nghiệm in vivo trên chuột
Hình 2.14. Quy trình kháng khuẩn in vivo của tinh dầu lá Cúc vàng trên chuột trắng mắt đỏ
2.6.1. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị sản phẩm từ tinh dầu từ lá Cúc được pha loãng ở nồng độ tối ưu với khả năng kháng khuẩn được khảo sát ở thí nghiệm kháng khuẩn với S.aureus.
Điều trị bằng băng gạt có tẩm tinh dầu
Làm sạch phần da cần khảo sát
Gây nhiễm khuẩn trên phần da đã được làm sạch
Quan sát biểu hiện trên da chuột
Chuột trắng mắt đỏ nuôi thuần
Chuột bạch được cung cấp bởi viện Pasteur với trọng lượng 18 – 20g , độ tuổi từ 3 – 4 tuần tuổi, phịng ni những chú chuột này ln phải đảm bảo duy trì nhiệt độ cố định là 25 - 26 độ C, độ ẩm 60 – 70 % bằng hệ thống điều hồ khơng khí.
Chuẩn bị vi khuẩn: Staphylococcus aureus.
2.6.2. Nguyên tắc
Theo tài liệu “thử nghiệm phi lâm sàn và lâm sàn thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” (Phạm Thanh Kỳ, 2015). Nuôi dưỡng và chăm sóc: động vật phải nuỗi giữ trong điều kiện mơi trường thí nghiệm, n tĩnh, thống khí, nhiệt độ từ 20 – 300C, độ ẩm 60 – 75%. Có đủ chuồng đề ni giữ động vật. Chuồng phải có kích thước phù hợp, có đủ chỗ để thức ăn, nước uống, thoáng, sạch sẽ, dễ làm vệ sinh. Những lồi nhỏ như chuột nhắt có thể ni nhốt theo từng nhóm tương ứng với các mức liều thử, động vật lớn cần nuôi giữ từng con. Động vật cần được lưu giữ trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 2 ngày (với động vật nhỏ) hoặc 5 ngày (với động vật lớn) trước khi thí nghiệm.
Tơn trọng giờ cho ăn hàng ngày để không ảnh hưởng đến hấp thụ thuốc và tránh sự căng quá mức của dạ dày. Thường cho uống thuốc vào sáng hôm sau tức là sau khoảng 16 giờ kể từ khi cho ăn bữa cuối cùng của ngày hôm trước .
Trọng lượng của động vật phải cân vào lúc đói, trước thí nghiệm. Nhận động vật thí nghiệm từ các nơi cung cấp, cân nặng cũng phải tính lúc đói.
2.6.3. Tiến hành
Nuôi thuần chuột bạch trong môi trường yên tĩnh, thống khí, nhiệt độ từ 20- 300C, độ ẩm 60 – 75%. Trong vòng 2 tuần.
Mật độ ni 3con/chuồng, có đủ thức ăn và nước uống, cho ăn 2 lần vào buổi sang
2.6.3.1. Thí nghiệm 1: khảo sát độ kích ứng với vết thưởng hở trên da chuột trắng mắt đỏ trắng mắt đỏ
Sau 2 tuần nuôi thuần chuột, làm sạch lông trên phần da trên phần lưng nằm trong khoảng cụt sọ đến khảng cụt đi chuột thí nghiệm, tạo vết thương hở dài khoảng 5 mm trên phần da đã được cạo lông.
Quan sát và ghi nhận kết quả trên da chuột trắng mắt đỏ đã được tạo vết thương hở và ghi lại kết quả.
Điều trị bằng sản phẩm có chứ tinh dầu lá Cúc vàng được pha lỗng với nồng độ thí hợp được sử dụng trên da với nồng độ tỏng khoảng 0,2 – 1,5%( Robert và Rodney, “esential oil safety”, 2014).
Khảo sát số lần sử dụng sản phẩm trên da chuột trắng mắt đỏ. 1 lần/ ngày, 2 lần/ ngày và 3 lần/ ngày. Quan sát và ghi nhật kết quả hồi phục vết thương hở của các nhóm chuột thí nghiệm trong 24h và 48h.
2.6.3.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tính kháng klhuẩn Staphylococcus aureus trên da chuột trắng mắt đỏ da chuột trắng mắt đỏ
Sau 2 tuần nuôi thuần chuột, làm sạch lông trên phần da trên phần lưng nằm trong khoảng cụt sọ đến khảng cụt đi chuột thí nghiệm, sau đó gây nhiễm S. aureus bằng cách bôi khuẩn trên bề mặt da đã được làm sạch và để 24h.
Quan sát biểu hiện trên phần da đã được gây nhiễm của chuột trắng mắt đỏ đã được gây nhiễm và ghi lại kết quả đối chứng.
Điều trị bằng sản phẩm có chứa tinh dầu lá Cúc vàng được pha với nồng độ thích hợp từ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn với S.aureus. Quan sát và ghi nhận kết quả sau 24h, 48h, 72h.
2.6.4. Thu thập và xử lý số liệu
Quan sát biểu hiện trên da chuột và ghi nhận. sau các mốc thời gian 12h, 24h, 48h, 72h.