CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.7. Phương pháp thử nghiệm kích ứng trên thỏ
Hình 2.15. Quy trình thử nghiệm kích ứng trên da thỏ của dầu dưỡng môi 2.7.1. Chuẩn bị mẫu thử 2.7.1. Chuẩn bị mẫu thử
Thỏ trắng trưởng thành, khơng phân biệt giới tính đơn chủng và khơng quá 2kg được ni thuần ít nhất 2 tuần trước khi tiến hành thử nghiệm phịng ni thỏ này ln phải đảm bảo duy trì nhiệt độ cố định là 25 – 26oC, độ ẩm 60 – 70 % bằng hệ thống điều hồ khơng khí (TCVN 7391-2:2005).
Sản phẩm dầu dưỡng mơi dùng để khiểm tra kích ứng trên da thỏ.
2.7.2. Nguyên tắc
Điều kiện của da là một nhân tố quan trọng. Chỉ sử dụng động vật còn nguyên da và khỏe mạnh. Thường cạo lông trên lưng của động vật một khoảng cách đủ trên cả hai
Làm sạch phần da cần khảo sát
Thoa đều 0,5 ml sản phẩm dầu dưỡng lên da đã làm sạch
Quan sát biểu hiện trên da thỏ Trong 2h, 4h, 8h, 12h, 24h và 48h
Thỏ trắng nuôi thuần
phía của xương sống để ứng dụng và quan sát tất cả các vị trí thử (khoảng 10 cm x 15 cm) trong vòng 24 h đến 4 h của cuộc thử. Lơng có thể bị cạo lại để dễ quan sát và/hoặc giúp cho việc tiếp xúc lặp lại. Có thể sử dụng thuốc làm rụng lơng do các kỹ thuật viên được đào tạo tiến hành, nếu quá trình này được đánh giá thuận lợi cho phép thử. Nếu cần tiếp xúc lặp lại tiến hành theo quy trình trong 21 ngày. Phải đánh giá tiềm năng của vật liệu đưa thử gây ra kích thích da trong mơ hình động vật tương ứng.
Thỏ là động vật thử được ưu tiên sử dụng.
Phủ vị trí ứng dụng bằng băng (bán hút hay hút) tối thiểu là 4 h. Cuối thời gian tiếp xúc loại bỏ mảnh băng phủ và đánh dấu vị trí bằng mực khơng trôi. Loại bỏ dư lượng vật liệu thử bằng các phương tiện thích hợp, chẳng hạn như rửa bằng nước ấm hoặc dung môi không gây kích thích phù hợp và làm khơ cẩn thận (TCVN 7391-2:2005).
2.7.3. Tiến hành
Nuôi thuần thỏ trong 2 tuần 25 – 26oC, độ ẩm 60 – 70 % bằng hệ thống điều hồ khơng khí (TCVN 7391-2:2005).
Cạo lông trên lưng của động vật một khoảng cách đủ trên cả hai phía của xương sống để ứng dụng và quan sát tất cả các vị trí thử (khoảng 10 cm x 15 cm) trong vòng 24 h.
Thoa đều 0,5 ml dầu dưỡng mơi lên trên bề mặt da với diện tích 2,5 cm x 2,5 cm. Quan sát và ghi nhận số liệu.
CHÚ DẪN
1 Điểm cùng sọ 5 Vị trí đối chứng 2 Vị trí thử 6 Vị trí thử
3 Vị trí đối chứng 7 Điểm cùng đi 4 Vùng lưng bị cạo
Hình 2.16. Các vị trí thử nghiệm trên da thỏ (TCVN 7391-2:2005) 2.7.4. Thu thập và xử lý số liệu
Đánh giá phản ứng phù nề, hình thành vảy, viêm sau 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h, 48h.
Đánh giá theo các tiêu chí theo (TCVN 7391-2:2005)
Bảng 2.8. Chỉ tiêu đánh giá phản ứng trên da động vật in vivo
Phản ứng Điểm số kích thích cơ bản
Ban đỏ và hình thành vảy
Ban đỏ rất nhẹ (vừa đủ cảm nhận) 1
Ban đỏ rất rõ 2
Ban đỏ vừa phải 3
Ban đỏ nghiêm trọng (như củ cải đỏ) đến đóng vảy cản trở sự phân loại ban đỏ
4
Hình thành Phù nề
Không phù nề 0
Phù nề rất nhẹ (vừa đủ cảm nhận) 1
Phù nề rõ (bờ của vùng nổi lên rõ) 2
Phù nề vừa phải (nhô lên xấp xỉ 1
mm) 3
Phù nề nghiêm trọng (nhô lên hơn 1 mm và phát triển ra xa vùng tiếp cận)
4
Tổng điểm số kích thích có thể 8
Các thay đổi có hại khác tại vị trí trên da phải được ghi lại và báo cáo.
Đối với mỗi động vật cộng các điểm số kích thích cơ bản cho cả phù nề và ban đỏ tại mỗi thời điểm quy định. Chia tổng này cho tổng số lần quan sát để nhận được điểm số kích thích trên mỗi động vật.
Cộng tổng các điểm số kích thích của tất cả các động vật và chia cho tổng số động vật. Giá trị này là chỉ số kích thích lũy tích.
Chỉ số kích thích lũy tích được so sánh với các loại phản ứng kích thích quy định trong Bảng 2.9. và loại phản ứng thích hợp ghi trong báo cáo.
Bảng 2.9. Loại phản ứng kích thích ở động vật
Điểm số trung bình Loại phản ứng
0 đến 0,4 Không đáng kể
0,5 đến 1,9 Nhẹ
2 đến 4,9 Vừa phải
5 đến 8 Mạn
2.8. Thử nghiệm tạo dầu dưỡng môi co chứa tinh dầu Cúc
Dựa trên các thành phần của sản phầm (dầu dưỡng môi trà xanh ) của thương hiệu Innisfree. Cải tiến một số thành phần không cần thiết.
Bổ sung trinh dầu Cúc ở nồng độ 1%
Đánh giá chỉ tiêu kim loại nặng theo thông tư 06/2011/TT-BYT.
2.9. Thống kê và xửa lý số liệu
Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hồn tồn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm MicroSoft Excel 2019® và phần mềm xử lý số liệu SAS 9.4. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các số liệu trung bình có cùng ký tự a, b,... thì khơng có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của trạng thai và kích thướng nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi đến hàm lượng tinh dầu cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu lá cúc, thời gian chưng cất, tỷ lệ nguyên liệu : nước chưng, nồng độ NaCl và thời gian ngâm nguyên liệu. Ghi lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi trường hợp, từ đó xác định được nguyên liệu để nguyên, xay 60 giây, để nguyên (5 – 8 x 9 – 12 cm) hay cắt nhỏ là tối ưu trong quá trinh chưng cất lôi cuốn hơi nước trục tiếp.
Cụ thể kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc Cúc
Kích thước nguyên liệu (lá Cúc)
Thể tích tinh dầu
(ml)
Hàm lượng tinh dầu (%)
Để nguyên lá 0,2300c 0,0657c
Cắt nhỏ ( 3 x 3 cm) 0,2933b 0,0838b
Biểu đồ 3.1. Kết quả ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc
Nhận xét và thảo luận:
Cố định 5 yếu tố: nguyên liệu lá cúc tươi, thời gian chưng cất 150 phút, nồng độ muối 15%, tỷ lệ nguyên liệu và nước chưng là 1:3 và không ngâm nguyên liệu.
Sau khi khảo sát, ghi nhận mẫu lá khi xây 60 giây thu được 0,3800 ml tinh dầu (hàm lượng tinh dầu đạt 0,1085%) cao hơn so với khi để nguyên lá chỉ thu được 0,2300 ml tinh dầu (hàm lượng tinh dầu đạt 0,0657%), và mẫu lá khi cắt nhỏ (3 – 3 cm) thu được 0,2933 ml tinh dầu (hamg lượng tinh dầu đạt 0,0838%)
Khi xay 60 giây, các tế bào lơng tiết sẽ bị phá vỡ cấu trúc, giải phóng các túi tinh dầu, tinh dầu dễ thốt ra mơi trường bên ngồi và hơi nước có nhiệm vụ lơi cuốn tinh dầu tự do ra bình hứng. Từ kết quả trên cho thấy việc xay nguyên liệu trong 60 giây sẽ cho hàm lượng lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chương cất lôi cuốn hơi nước cao, thu nhận tinh dầu trong thời gian ngắn và tránh thất thoát tinh dầu.
Kết quả khảo sát trên cho thấy kích thước nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu thu được, kích thức càng bé lượng tinh dầu thu được càng nhiều, nhiều nhất là
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Để nguyên lá (5 – 8 x 9 – 12 cm) Cắt nhỏ (3 x 3 cm) Xay 60 giây 0,0657 0,0838 0,1085
khi xay nguyên liệu trong 60 giây. Trong thí nghiệm này, việc xay nguyên liệu lá Cúc vàng trong 60 giây thu nhận được hàm lượng tinh dầu cao nhất.
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian làm héo đến hàm lượng tinh dầu Cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dầu Cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Từ kết quả thí nghiệm 1 chúng tơi thu được kết quả kích thước ngun liệu tối ưu nhất cho quy trình thu nhận tinh dầu lá Cúc vàng là xay 60 giây. Để tiếp tục tìm được điều kiện trích ly tốt nhất chúng tơi đã khảo sát thí nghiệm 2.
Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu xay nhuyễn, nồng độ muối, thời gian ngâm nguyên liệu và thay đổi 4 loại nguyên liệu cành hoa: lá tươi, làm héo 24 giờ, làm héo 48 giờ. Sau khi trích ly, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, chọn lấy thời gian làm héo tối ưu.
Cụ thể kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc vàng Nguyên liệu (lá cúc) Độ ẩm (%) Thể tích tinh dầu (ml) Hàm lượng tinh dầu (%) Tươi 91,34 0,3733a 0,1066a Héo 24h 62,43 0,2733b 0,0780b Héo 48h 47,28 0,2267c 0,0647c
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc vàng
Nhận xét và thảo luận:
Cố định yếu tố: mẫu lá, thời gian chưng cất 150 phút, không ngâm mẫu, nguyên liệu lá xay nhuyễn, tỷ lệ nguyên liệu và nước chưng là 1:3, nồng độ muối chưng cất 15%.
Sau khi khảo sát, nghi nhận kết quả từ bảng 3.2. cho thấy mẫu lá tươi thu được 0,3733 ml tinh dầu (hàm lượng 0,1066%) cao hơn so với mẫu lá làm héo 24h thu được 0,2733 ml tinh dầu (hàm lượng 0,0780% và mẫu lá làm héo 48h thu được 0,2267 ml tinh dầu (hàm lượng 0,0647%)
Căn cứ vào bảng 3.2. và biểu đồ 3.2. cho thấy rằng thời gian làm héo nguyên liệu ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng tinh dầu thu được trong mẫu, thời gian làm héo càng tăng, lượng tinh dầu thu được càng ít dần. Vì nước trong các tế bào lơng tiết mất đi sẽ lôi cuốn theo hạt tinh dầu thất thoát vào môi trường, và khi làm héo các cấu trúc
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
Tươi Héo 24h Héo 48h
0,1066
0,0780
0,0647
cellulose, lignin co lại tạo thành lớp bao bên ngồi vững chắc cản trở việc thốt tinh dầu ra ngoài khi chưng cất. làm cho hàm lượng tinh dầu giảm.
Đối với việc thu nhận tinh dầu từ lá Cúc vàng, chúng tôi cho rằng lá Cúc tươi thích hợp cho việc thu nhận tinh dầu.
3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NaCl đến hàm lượng tinh dầu Cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Từ TN1 và TN2, chúng tôi thu được kết quả, lá Cúc tươi độ ẩm (91,34%) xay trong 60 giây thích hợp cho q trình trích ly tinh dầu. tiếp tục cố định thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được xay nhuyễn, nguyên liệu lá cúc, thay đổi nồng độ muối chưng cất như sau: 0%, 5%, 10%,15%, 20%. So sánh lượng tinh dầu thu được để tìm ra nồng độ muối tối ưu.
Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc Nồng độ NaCl Nồng độ NaCl
(%)
Thể tích tinh dầu
(ml)
Hàm lượng tinh dầu (%) 0 0,2300e 0,0657c 5 0,2533d 0,0723c 10 0,2800c 0,0814b 15 0,3667a 0,1047a 20 0,2967b 0,0847b
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc Nhận xét và thảo luận:
Cố định 5 yếu tố: mẫu lá tươi, xay 60 giây, thời gian chưng cất 150 phút, không ngâm mẫu, tỷ lệ nguyên liệu: nước chưng là 1:3.
Sau khi khảo sát, ghi nhận tỷ lệ muối 15% thu được 0,3667 ml tinh dầu( hàm lượng 0,1047%) cao hơn tỷ lệ muối 0% thu được 0,2300 ml tinh dầu( hàm lượng 0,0657%), tỷ lệ muối 5% thu được 0,2533 ml tinh dầu( hàm lượng 0,0723%), tỷ lệ muối 10% thu được 0,2800 ml tinh dầu( hàm lượng 0,0814%) và tỉ lệ muối 20% thu được 0,2967 ml tinh dầu (hàm lượng 0,0847%).
Từ kết quả của thí nghiệm này cho thấy, việc bổ sung NaCl vào nước chưng giúp làm tăng hàm lượng tinh dầu lá Cúc vàng. Nồng độ NaCl càng tăng thì hàm lượng tinh dầu thu được càng tăng. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NaCl đến 20% thì hàm lượng tinh dầu giảm hẳn. Khi chưng cất tạo hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tranh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thanh phần không phân cực của tinh dầu vào trong nước. Việc thêm NaCl vào quá trình chưng cất nhằm mục đích tăng hiệu suất ly trích do NaCl hồ tan trong nước sẽ tạo thanh dung dịch điện
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 5 10 15 20 0,0657 0,0723 0,0814 0,1047 0,0847 NỒNG ĐỘ NACL (%)
ly dẫn đến làm tăng nhiệt độ sôi (hay làm giảm áp suất hơi) của nước, giảm sự bay hơi của nước trong hỗn hợp, do đó tinh dầu trích ly được nhiều hơn (Furter và Cook, 1967).
Tuy nhiên, khi chưng cất với nồng độ NaCl lớn hơn (20% trở lên), lượng tinh dầu thu được sẽ bị giảm, điều này có thể giải thích do sử dụng NaCl ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngồi co lại cản trở sự thăng hoa của tinh dầu.
Vì vậy, chúng tơi cho rằng hàm lượng NaCl 15% là tối ưu cho quá trinh trích ly tinh dầu từ lá Cúc vàng.
3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu Cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu Cúc vàng thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Khảo sát nồng độ NaCl thu được mẫu ở nồng độ NaCl 15% cho hàm lượng tinh dầu cao nhất. Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thốt ra mơi trường bên nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay từ đầu và thể tích tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi chưng cất (Huỳnh Chí Hiếu, 2017).Cố định các yếu tố: nguyên liệu lá Cúc vàng, thời gian chưng cất, tỷ lệ nguyên liệu: nước chưng, nguyên liệu tươi và xay 60s, nồng độ NaCl và thay đổi thời gian để ngâm nguyên liệu như sau: 0 phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn mức thời gian để ngâm tối ưu.
Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc Cúc
Thời gian ngâm mẫu
(phút)
Thể tích tinh dầu
(ml)
Hàm lượng tinh dầu (%)
5 0,3767b 0,1076a
10 0,2800c 0,0800b
15 0,2400d 0,0685c
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu lá Cúc
Nhận xét và thảo luận:
Cố định 5 yếu tố: mẫu lá tươi, xay 60 giây, thời gian chưng cất 150 phút, tỷ lệ nguyên liệu và nước chưng là 1:3, nồng độ muối chưng cất 15%.
Sau khi khảo sát, ghi nhận mẫu không ngâm thu được 0,3833 ml tinh dầu (hàm lượng 0,1095%) bằng với thời gian ngâm mẫu 5 phút thu được 0,3767 ml tinh dầu (hàm lượng 0,1076%) cao hơn thời gian ngâm mẫu 10 phút thu được 0,2800 ml tinh dầu (hàm lượng 0,0800%) và thời gian ngâm mẫu 15 phút thu được 0,2400 ml tinh dầu (hàm lượng 0,0685%) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 5 10 15 0,1095 0,1076 0,0800 0,0685
Từ kết quả của bảng 3.4. và biểu đồ 3.4. cho thấy, thời gian ngâm mẫu ảnh hưởng đáng kể đến quá trinh trích ly tinh dầu từ lá Cúc vàng. Do thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl có thể làm thất thát tinh dầu ra mơi trường bên ngồi (khiến tinh dầu bị bay hơi khi chưng cất ). ì vậy, để tiết kiệm thời gian chưng cất cũng như tránh việc thất thoát tinh dầu, nên chưng cất mẫu ngay để thu được hàm lượng tinh dầu lớn nhất. Thời gian ngâm nguyên liệu tỷ lệ nghịch với hàm lượng tinh dầu thu được, việc