E. coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước 2 x 0,6 – 3 x 0,6 𝜇m.
Trong cơ thể E. coli có dạng trực khuẩn hình cầu, đứng riêng lẻ đơi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn E. coli có khả năng di động do có lơng xung quanh thân. Vi khuẩn khơng sinh nha bào, có thể có giáp mơ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
E. coli lên men sinh hơi các loại đường fructose, glucose, lactose, levulose,
galactose, xylose, ramnose, mannit, H2S âm tính (Nguyễn Như Thanh, 1997). Chúng sinh Indole, methyl red dương tính, khơng có khả năng sử dụng citrate, khử
nitrate và lên men decarboxylase với arginine, lysine (Trần Linh Thước, 2010).
E. coli gây bệnh qua nhiều con đường khác nhau nhưng chủ yếu là đường tiêu
hóa. Chúng có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ gây bệnh cho sức đề kháng của con vật bị giảm sút. Bệnh do E.coli gây ra giống như một bệnh truyền nhiễm kế phát do thiếu vitamin và mắc các bệnh virus, ký sinh trùng.
1.3.3. Salmonella
Năm 1874, nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một loại vi khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn.
Năm 1880, Karl Joseph Eberth và Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh sốt thương hàn ở người.
Năm1884, Georg Gaffky thành công trong việc cấy mầm bệnh trong mơi trường ni cấy thuần khiết.
Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer Salmon tìm thấy vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được đặt theo tên của ơng.
Hình 1.10. Vi khuẩn Samonella
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi
khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tuỳ nghi, khơng tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính 0,7 μm đến 1,5 μm, dài từ 2 – 5 μm và có vành lơng rung hình sợi.
Salmonella được tìm thấy trên tồn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động
vật máu nóng, và trong mơi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis). Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nơn xuất hiện sau 12 – 36 giờ
sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo dài từ 2 – 7 ngày.
Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi trường. Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng s màu trắng xám.
Salmonella được phân loại dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên. Hiện
nay có khoảng 1.500 typ huyết thanh (cịn gọi là lồi) Salmonella. Đặt tên cho mỗi lồi
Salmonella mới tìm ra có thể lấy tên động vật mang mầm bệnh hoặc tên địa phương đã
phân lập ra chúng lần đầu tiên. Sau đây là một số loài Salmonella đáng được chú ý nhất:
− S. typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhi
gây ra.
− S. paratyphi A: cũng chỉ gây bệnh thương hàn cho người. Ở nước ta cũng hay
gặp loài này sau S. typhi.
− S. paratyphi В: gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật.
Bệnh thường gặp ở các nước Châu Âu.
− S. paratyphi С: vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây viêm
dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết thường gặp ở các nước đông nam Châu Á.
− S. typhimurium và S. enteritidis gây bệnh cho người và súc vật. Hai loài này là
nguyên nhân chủ yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do Salmonella. − S. choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do
Salmonella ở nước ta.
1.3.4. Bacillus cereus
Bacillus cereus là một vi khuẩn Gram dương , hình que, kỵ khí tuỳ nghi, sinh nội
bào tử, bào tử thường được tìm thấy trong đất và thực phẩm. Tên cụ thể, cereus, có nghĩa là "sáp" trong tiếng Latinh , đề cập đến sự xuất hiện của các khuẩn lạc được trồng trên thạch máu . Một số chủng có hại cho con người và gây bệnh do thực phẩm , trong khi các chủng khác có thể có lợi như chế phẩm sinh học cho động vật. Vi khuẩn cổ điển lây nhiễm từ các món cơm chiên đã được để ở nhiệt độ phòng trong nhiều giờ. Vi
khuẩn B. cereus là vi khuẩn kỵ khí dễ ni và giống như các thành viên khác của chi Bacillus , có thể sinh nội bào tử bảo vệ . Yếu tố độc lực của nó bao gồm cereolysin và phospholipase C .
Hình 1.11. Tế bào Vi khuẩn Bacillus cereus
B. cereus cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong ruột sự hiện diện của nó làm
giảm số lượng các vi sinh vật đó. Trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm chăn nuôi, một số chủng B. cereus vô hại được sử dụng như một chất phụ gia thức ăn probiotic để giảm Salmonella trong ruột và manh tràng của động vật . Điều này giúp cải thiện sự phát triển của động vật, cũng như an tồn thực phẩm cho người.
B. cereus có thể gây ra buồn nôn , nôn mửa và tiêu chảy nghiêm trọng . Bệnh do
trực khuẩn thực phẩm này xảy ra do sự tồn tại của nội bào tử vi khuẩn khi thực phẩm bị nhiễm bệnh không được nấu chín kỹ. Nhiệt độ nấu ăn nhỏ hơn hoặc bằng 100°C (212°F) cho phép một số bào tử B. cereus tồn tại. Vấn đề này càng phức tạp khi thực phẩm được bảo quản lạnh không đúng cách , tạo điều kiện cho nội bào tử nảy mầm. Thực phẩm nấu chín khơng ăn ngay hoặc làm lạnh nhanh và làm lạnh nên được giữ ở nhiệt độ dưới 10°C (50°F) hoặc trên 50°C (122°F). Sự nảy mầm và tăng trưởng thường xảy ra trong khoảng từ 10°C đến 50°C, mặc dù một số chủng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp . Sự phát triển
của vi khuẩn tạo ra độc tố ruột, một trong số đó có khả năng chịu nhiệt và axit cao ( độ pH từ 2 đến 11), ăn phải dẫn đến hai loại bệnh: hội chứng tiêu chảy và nôn mửa.
B. cereus cũng được biết là gây nhiễm trùng da mãn tính khó điều trị khỏi, mặc dù
ít hung hãn hơn so với viêm cân hoại tử . B. cereus cũng có thể gây viêm giác mạc. Để phân lập và định danh B. cereus theo tiêu chuẩn hóa bởi Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế (ISO): ISO7931 và ISO21871.
Tăng sinh kỵ khí: dương tính
Kiểm tra Voges Proskauer: dương tính Axit được sản xuất từ
D-glucose: dương tính L-arabinose: dương tính D-xylose: Âm tính D-mannitol: Âm tính
Thủy phân tinh bột : dương tính Giảm nitrat: dương tính
Phân huỷ tyrosine: dương tính
sinh trưởng ở điều kiện > 50° C: Âm tính Sử dụng citrate: dương tính
1.4. Một số phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Hai phương pháp chính dùng để xác định hoạt tính kháng vi sinh vật là phương pháp khuếch tán trên thạch và phương pháp pha loãng.
1.4.1. Phương pháp khuếch tán trên thạch a. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán a. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán
Thường áp dụng với các chất không thể khuếch tán trong bản thạch. Đây là thử nghiệm đi trước thử nghiệm MIC. Là phương pháp hay dùng để làm kháng sinh đồ.
Nguyên tắc: dùng đĩa giấy có tẩm dung dịch chất thử đặt lên mặt thạch đã tráng
một lớp huyền dịch vi khuẩn. Chất thử sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế.
Ưu điểm: nhanh, gọn, thực hiện dễ dàng.
Nhược điểm: nếu chất thử không khuếch tán vào bản thạch sẽ cho kết quả sai lệch. b. Phương pháp đục lỗ
Nguyên tắc: dùng đĩa thạch đã được tráng sẵn một lớp huyền dịch vi khuẩn, để
khô mặt thạch, đục các lỗ tròn đến đáy hộp. Cho dung dịch thử vào các lỗ tròn, chất thử sẽ khuếch tán vào lớp thạch xung quanh, tạo vùng ức chế quanh chỗ đục lỗ (vịng vơ khuẩn).
Ưu điểm: có thể thực hiện với hầu hết mọi chất.
Nhược điểm: cần thăm dị để tìm ra dung dịch đệm và môi trường để chất thử
nghiệm khuếch tán tốt nhất. Phương pháp này cũng đòi hỏi thời gian và kinh nghiệm. Đối với các phương pháp trên, chất thử được coi là có tính kháng khuẩn nếu có vịng ức chế rõ ràng. Nếu vi khuẩn trên bề mặt thạch mọc yếu hay các chất thử nghiệm có khả năng bay hơi thì cần lặp lại bằng phương pháp pha loãng.
1.4.2. Phương pháp pha loãng
a. Phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng
Nguyên tắc: trong một dãy các ống nghiệm có chứa mơi trường lỏng đã pha sẵn chất
thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, dùng pipet vô trùng để đưa vi khuẩn thử nghiệm vào. Đem ủ ở 35 – 37oC trong vịng 16 – 20 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng (môi trường sẽ trong), ngược lại, nếu có sự tăng trường của vi khuẩn, mơi trường sẽ đục.
Nhược điểm: chỉ áp dụng được với các chất dễ tan trong nước. b. Phương pháp pha loãng trong thạch
Nguyên tắc: pha lỗng chất thử vào mơi trường thạch đun chảy, đổ vào đĩa petri.
Chấm huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch, ủ từ 16 – 24 giờ. Nếu có khóm vi khuẩn mọc lên thì chất thử khơng có tác dụng, nếu vi khuẩn khơng mọc thì chất thử có tác dụng ức chế. Trường hợp vi khuẩn mọc yếu thì cần lặp lại thử nghiệm, kiểm tra các yếu tố có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm (chất nhũ hóa, dung mơi hịa tan, nhiệt độ mơi trường,…).
Ưu điểm: có thể sử dụng cho các chất khó tan, khơng tan trong mơi trường.
Nhược điểm: phương pháp này đòi hỏi kinh nghiệm trong việc chấm vi khuẩn lên
bản thạch và phương pháp này đòi hỏi số lượng vi khuẩn mỗi lần chấm là như nhau.
1.4.3. Phương pháp compact dry
ComPact Dry là dạng đĩa nhựa chứa môi trường vi sinh pha sẵn đông khô, được chuẩn bị sẵn với thành phần môi trường như phương pháp ISO truyền thống, có cải tiến. Với thiết kế nhỏ, gọn giúp tiết kiệm không gian tủ ủ, thao tác đơn giản và không mất thời gian cho khâu chuẩn bị môi trường.
a. Ưu điểm khi sử dụng Đĩa Compact Dry – Môi trường vi sinh pha sẵn
Giảm thời gian chuẩn bị môi trường vi sinh
Thiết kế nhỏ gọn, tiện lợi tiết kiểm không gian tủ ấm và thao tác Bảo quản nhiệt độ phòng
Giá thành rẻ và cho kết quả chính xác theo tiêu chuẩn Quốc tế: Iso 9001:2008, AOAC, MicroVal, NordVal,…
Đáp ứng trên nhiều nền mẫu:
Mẫu rắn: thịt, tôm, cá, thức ăn chăn nuôi, sữa, sữa bột , sữa lỏng,…
Mẫu lỏng: Nước sinh hoạt, nước thải,… theo phương pháp trực tiếp và phương pháp màng lọc
Đĩa ComPact Dry do hãng Nissui Pharma – Nhật Bản sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001:2008 và hầu hết các loại đĩa đã đạt chứng nhận của các tổ chức quốc tế như: AOAC, MicroVal, NordVal.
Đĩa môi trường vi sinh pha sẵn Compact Dry – Nissui đáp ứng nhiều chủng loại vi khuẩn: Ecoli, Coliform, Tổng vi khuẩn hiếu khí, Staphylococcus aureus, Vi khuẩn đường ruột – Enterobacteria, Nấm mốc, Listeria, Salmonella, vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus, Vi khuẩn bacillus cereus và Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa…
Hình 1.12. Quy trình sử dụng đĩa compact dry
b. Thông tin chi tiết của một số môi trường compact dry
compact Dry EC (Escherichia coli và Coliform):
Đĩa môi trường đông khô chuẩn bị sẵn để kiểm E.coli và Coliform
Áp dụng cho các loại nền mẫu: rắn (thịt, tôm cá, trứng, thức ăn chăn nuôi), sữa (sữa bột, sữa lỏng), nước (trực tiếp hoặc màng lọc).
Thời gian ủ: 24±2 giờ Nhiệt độ ủ: 35±2℃ Hình dạng khuẩn lạc:
E.coli: khuẩn lạc màu xanh, xanh tím Coliform: tất cả khuẩn lạc màu đỏ và xanh
Compact Dry SL (Salmonella):
Đĩa môi trường đông khô chuẩn bị sẵn để kiểm Salmonella
Áp dụng cho các loại nền mẫu: rắn (thịt, tôm cá, trứng, thức ăn chăn nuôi), sữa (sữa bột, sữa lỏng), nước (trực tiếp hoặc màng lọc).
Đạt các chứng nhận: đang submit chứng nhận AOAC RI Thời gian ủ: 20 -24 hours
Nhiệt độ ủ: 35 – 37℃
Hình dạng khuẩn lạc: màu xanh lá
Compact Dry X-SA (Staphylococcus aureus):
Đĩa môi trường đông khô chuẩn bị sẵn để kiểm Staphylococcus aureus (không cần test khẳng định)
Áp dụng cho các loại nền mẫu: rắn (thịt, tôm cá, trứng, thức ăn chăn nuôi), sữa (sữa bột, sữa lỏng), nước (trực tiếp hoặc màng lọc).
Đạt các chứng nhận: AOAC RI, MicroVal, NordVal Thời gian ủ: 24±2 giờ
Nhiệt độ ủ: 35±2℃
Hình dạng khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh nhạt
Đĩa môi trường đông khô chuẩn bị sẵn để kiểm Bacillus cereus
Áp dụng cho các loại nền mẫu: rắn (thịt, tôm cá, trứng, thức ăn chăn nuôi), sữa (sữa bột, sữa lỏng), nước (trực tiếp hoặc màng lọc).
Đạt các chứng nhận: MicroVal, NordVal Thời gian ủ: 24 giờ
Nhiệt độ ủ: 30℃
Hình dạng khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh
1.5. Giới thiệu phương pháp thí nghiệm trên động vật
Thử nghiệm động vật (Animal testing) hay cịn được gọi là thí nghiệm trên động vật, nghiên cứu động vật (animal research) và thử nghiệm in vivo là việc sử dụng các lồi động vật (khơng phải là con người) trong các thí nghiệm nhằm kiểm sốt các biến tố ảnh hưởng đến hành vi hoặc hệ thống sinh học đang được nghiên cứu, những động vật được chọn thí nghiệm gọi là sinh vật mơ hình. Cách tiếp cận này có thể tương phản với các nghiên cứu hiện trường, trong đó những động vật được quan sát thấy trong môi trường tự nhiên của chúng.
Các nghiên cứu thử nghiệm với động vật thường được tiến hành tại các trường đại học, các trường y, các cơng ty dược phẩm, các cơ sở quốc phịng và các cơ sở thương mại cung cấp các dịch vụ kiểm tra động vật cho ngành công nghiệp. Trọng tâm của việc thử nghiệm trên động vật thay đổi liên tục từ nghiên cứu thuần túy, tập trung vào việc phát triển kiến thức căn bản về sinh vật, nghiên cứu ứng dụng, có thể tập trung trả lời một số vấn đề có tầm quan trọng thực tiễn lớn đặt ra, chẳng hạn như tìm ra phương pháp chữa bệnh. Các ví dụ về nghiên cứu ứng dụng bao gồm các thử nghiệm điều trị bệnh, chăn ni, nghiên cứu quốc phịng và độc tính, bao gồm cả kiểm tra mỹ phẩm (Thử nghiệm mỹ phẩm trên động vật).
Chuột nhắt, chuột cống, cá, lưỡng cư và bò sát cùng chiếm hơn 85% số động vật nghiên cứu, trong đó chuột cũng như các lồi gặm nhấm là những động vật được chọn
làm vật thí nghiệm nhiều vì tính sẵn có, chi phí thấp, giá thành rẻ, sinh sơi nhanh và có nhiều điểm tương đồng với con người. Hầu hết các động vật đều bị giết chết sau khi được sử dụng thử nghiệm tránh việc thất thốt ra bên ngồi. Nguồn động vật thí nghiệm khác nhau giữa các nước và loài; hầu hết động vật thí nghiệm được nhân giống sinh sản có mục đich tại các trung tâm nghiên cứu.
1.5.1. Thử nghiệm in vivo
In vivo trong tiếng Latin có nghĩa là q trình diễn ra trong cơ thể sống. Phương
pháp in vivo được dùng để chỉ những thí nghiệm dùng các mơ sống hay tồn bộ cơ thể cịn sống làm đối tượng thử nghiệm. Các phương pháp in vivo khác với in vitro (thí
nghiệm ngồi cơ thể sống, thử nghiệm trong ống nghiệm) và các thí nghiệm trên các mơ hay cơ thể đã chết. Thơng thường, khi nói đến in vivo, người ta thường nghĩ đến các thí nghiệm, thử nghiệm trên đối tượng là sinh vật sống. Các thí nghiệm sử dụng động vật hay các thử nghiệm lâm sàng trên người là ví dụ của nghiên cứu in vivo.
Christopher Lipinksi và Andrew Hopkins cho rằng dù thử nghiệm trên cơ thể sống để tìm kiếm các loại dược phẩm mới hay có thêm hiểu biết về cơ thể sinh vật vẫn phải đồng thời xem xét những cơng cụ hóa học và bản chất hóa học của đối tượng sinh vật. Thực tế cho thấy một hợp chất nào đó biểu hiện hoạt tính khi được thử nghiệm ngồi cơ thể sống (in vitro) như khả năng kết hợp với protein tái tổ hợp, thay đổi quá trình trao đổi chất tế bào hay thậm chí phá vỡ cấu trúc tế bào đã được phân lập... nhưng chưa chắc đã có hoạt tính mong muốn khi thử nghiệm trên cơ thể sống. Chính vì vậy thử nghiệm
in vivo vẫn được coi là bước thử nghiệm chắc chắn nhất sau khi các phương pháp in vitro đã được tiến hành.
Phương pháp in vivo sử dụng động vật thí nghiệm gặp phải sự phản đối của những cá nhân và tổ chức bảo vệ quyền động vật (animal rights). Mặc dù các cơ quan khoa học đều có các biện pháp kiểm duyệt chặt chẽ những quy trình thí nghiệm nhưng các vấn đề thuộc đạo đức sinh học ngày càng được quan tâm và gây nhiều tranh cãi. Đôi khi ta thấy