Saponin có nguồn gốc thực vật, nhưng chúng cũng đã được phân lập từ các sinh vật biển như hải sâm. Saponin thực sự tìm thấy trong nhiều thực vật và được dùng để đặt tên cho cây cỏ kiềm (chi Saponaria, họ Caryophyllaceae), gốc rễ
trong đó đã được sử dụng như một xà phòng. Saponin cũng được tìm thấy trong các họ thực vật Sapindaceae, với chi định danh Sapindus (soapberry hoặc
soapnut), trong các họ Aceraceae (cây phong) và Hippocastanaceae (hạt dẻ ngựa). Nó cũng được tìm thấy rất nhiều trong Gynostemma (Gynostemma,
Cucurbitaceae) trong gypenosides và nhân sâm hoặc nhân sâm đỏ (Panax, họ cuồng cuồng). Trong các họ, lớp này của các hợp chất hóa học được tìm thấy ở các bộ phận khác nhau của cây: lá, thân, rễ, củ, hoa và quả. Công thức thương mại của saponin nguồn gốc thực vật từ vỏ cây Quillaja Saponaria và các nguồn gốc khác có khả năng kiểm sốt được thơng qua các quy trình sản xuất được sử dụng như chất hóa học và y sinh học.
2.8.2. Vai trị của saponin
Ở thực vật, saponin được sử dụng như một chất bảo vệ cây chống lại vi khuẩn và nấm. Một số saponin thực vật (ví dụ như từ yến mạch và rau bina) có thể tăng cường hấp thu dinh dưỡng và hỗ trợ trong q trình tiêu hóa động vật. Tuy nhiên, saponin thường có vị cay đắng và do đó có thể làm giảm độ ngon miệng của thực vật (ví dụ trong thức ăn gia súc) hoặc thậm chí chúng thấm độc tính đe dọa tính mạng của động vật. Dữ liệu cho thấy rõ rằng một số saponin là chất độc đối với sinh vật máu lạnh và côn trùng ở nồng độ cụ thể.
Saponin từ cây Gypsophila paniculata đã được chứng minh là làm tăng
thêm đáng kể khả năng gây độc của các chất kháng độc tố và độc tố có mục tiêu khác nhằm chống lại các tế bào ung thư ở người. Các nhóm nghiên cứu của Giáo sư Hendrik Fuchs (Đại học Charité, Berlin, Đức) và Tiến sĩ David Flavell (Bệnh viện đa khoa Southampton, Vương quốc Anh) đang làm việc cùng nhau hướng tới sự phát triển của các saponin Gypsophila để sử dụng trong sự kết hợp với chất kháng độc tố hay độc tố nhắm mục tiêu khác cho bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu , u lympho và bệnh ung thư khác.
Saponin cũng đã được sử dụng như là chất phụ trợ vắc xin,ví dụ Quil A thành phần QS - 21, được cô lập từ vỏ cây Quillaja saponaria Molina, để kích
thích cả hai đáp ứng miễn dịch Th1 và sản xuất độc tế bào T-lymphocyte (CTL) chống lại các kháng nguyên ngoại sinh làm cho chúng lý tưởng cho việc sử dụng vắc xin tiểu đơn vị và vắc xin nhằm chống lại tác nhân gây bệnh nội bào cũng như đối với vắc-xin điều trị ung thư nhưng với những tác dụng phụ nói trên của tán huyết. Trong việc sử dụng chúng như chất phụ gia trong sản xuất vắc xin, độc tính liên quan với phức sterol vẫn cịn là một vấn đề lớn cần chú ý.
2.8.3. Các nghiên cứu về saponin trong bảo quản
Nghiên cứu của Weining Hao et al. (2010) cho thấy tea saponin (TS) ức chế sự nảy mầm của bảo tử và sinh trưởng của tản nấm Penicillium italicum, P.digitatum và Geotrichum candidum. TS kết hợp với chất hóa học imazalil và
prochloraz với tỷ lệ 8:2 được đánh giá là có hiệu quả trong phịng trừ mốc xanh, mốc lục và thối chua trên quýt ‘Shatang’.
Chủng Bacillus amyloliquefaciens HF - 01 được phân lập từ bề mặt quả có múi được sử dụng để đánh giá khả năng kiểm sốt Penicillium digitatum. Thí nghiệm được bố trí HF - 01 kết hợp với 50 μg mL−1 TS có khả năng kiểm sốt được trên 90 % mốc xanh, mốc lục và thối chua (Weining Hao et al., 2011).
Một nghiên cứu của M. Musto et al. (2014) cho thấy chiết suất lá cây
Solanum nigrum có chứa các thành phần như alkaloids, tannins, flavonoids,
saponins,… Chiết suất này có tác dụng ức chế nấm Penicillium digitatum trên đĩa thạch petri. Đồng thời chiết suất này cũng có tác dụng phịng nấm gây thối khi bảo quản chanh có lây nhiễm nhân tạo trong 7 ngày ức chế 100 %, đến ngày thứ 14 và 21 hoạt động này giảm khả năng ức chế chỉ còn tương ứng là 85,71 % và 57,14 %. Tác dụng trừ nấm chỉ đạt 14,29 % sau 7 ngày bảo quản.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Một số chợ đầu mối hoa quả trên Thành phố Hà Nội.
- Bộ môn Bệnh cây, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội.
- Thời gian: tháng 1/2016 - tháng 3/2017.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Quả cam Văn Giang, cam sành, quýt, bưởi da xanh và bưởi Diễn được mua tại vườn chưa được qua xử lý với bất kỳ hóa chất nào.
- Mơi trường ni cấy PDA, WA,…
- Dụng cụ thí nghiệm: đĩa pettri Ф 6, 9, pipet, găng tay, khẩu trang, que cấy, lamen,…
- Kính hiển vi, tủ cấy, buồng đếm bào tử, nồi hấp,…
- Các hóa chất: + Natri hidrocarbonate (NaHCO3): ARM&HAMMER của công ty Church& Dwight, Co.,Inc.
+ EDTA: mua tại Công ty cổ phần hóa chất Thắng Lợi Việt Nam Địa chỉ: 369 Ngô Gia Tự - Đức Giang - Long Biên - Hà Nội.
+ Chitosan: sản phẩm chiết xuất từ vỏ tôm, mua tại Công ty TNHH MTV chitosan VN. Địa chỉ: đường 23/6 Ngô Thời Nhiệm - Phường An Bình – TP Rạch Giá- Tỉnh Kiên Giang.
+ Saponin: chiết xuất từ cây du trà (Camellia drupifera), sản phẩm của Viện Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách khoa Hà Nội.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3.1. Điều tra tình hình phát triển của bệnh mốc xanh, mốc lục trên cây có múi tại Hà Nội múi tại Hà Nội
- Điều tra thành phần bệnh hại sau thu hoạch trên cây có múi tại một số chợ ở Hà Nội.
3.3.2. Xác định tác nhân gây bệnh
- Phân ly, nuôi cấy, chẩn đốn các bệnh hại sau thu hoạch trên cây có múi.
3.3.3. Các biện pháp phòng trừ
- Phương pháp hóa học: muối NaHCO3, EDTA.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp điều tra hiện trạng bệnh hại cây có múi sau thu hoạch
- Phương pháp điều tra theo Bộ NN&PTNT: "Quy chuẩn kỹ thuật Quốc Gia về phương pháp phát hiện dịch hại trên cây có múi. QCVN 01 - 119: 2012/BNNPTNT".
- Điều tra tại các khu chợ khác nhau trên địa bàn TP Hà Nội. Mỗi chợ điều tra 5 loại quả cây có múi: cam Văn Giang, cam sành, quýt, bưởi da xanh và bưởi Diễn. Lấy mẫu ở 10 thùng khác nhau, mỗi thùng điều tra 20 quả. Tổng số quả điều tra cho mỗi giống là 200 quả.
3.4.2. Phương pháp phân lập, chẩn đoán bệnh hại
Theo phương pháp của Lester W. Burgess et al. (2009) và Bùi Đông Hồ (2012):
- Mẫu quả bệnh được thu về, phân loại theo triệu chứng bệnh. Tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh.
- Chọn các mẫu có vết bệnh mới, chọn mơ có cả phần khơng bị và mơ bị bệnh. Khử trùng bằng cồn 70º, rửa lại bằng nước cất vô trùng và để khô trên giấy thấm tiệt trùng. Sử dụng panh và kéo cắt nhỏ mô bệnh và đặt trên đĩa mơi trường PDA ¼ có thể bổ sung kháng sinh.
- Để các đĩa petri đã phân lập trong tủ định ôn. Kiểm tra và ghi nhận sự phát triển của nấm.
- Nhận diện các mẫu nấm phân lập được, tiến hành cấy truyền, làm thuần và bảo quản mẫu nấm để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
- Đánh giá, định danh và làm thuần các loài vi sinh vật phân lập được.
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh thái của nấm
Theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III năm 1997, 2000.
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ với tác nhân gây bệnh.
- Các ngưỡng nhiệt độ trong thí nghiệm: 20 oC, 25 oC, 30 oC. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA, WA các ngưỡng nhiệt độ này được bố trí ổn định trong tủ định ơn. Mỗi mức nhiệt độ được nhắc lại 3 lần.
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu hiệu lực của một số thuốc hóa học, chế phẩm sinh học đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro sinh học đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
3.4.4.1. Nghiên cứu hiệu quả ức chế của một số chế phẩm sinh học và hóa học đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
Một số các vật liệu, hoạt chất như chitosan, saponin, muối NaHCO3, EDTA được phép sử dụng trong bảo quản một số loại quả ở Việt Nam. Các hóa chất trên được bổ sung trực tiếp vào môi trường PDA ở nhiệt độ 40 – 45 oC.
Các thí nghiệm được bố trí như sau:
Thí nghiệm 1: Hiệu quả ức chế của chitosan đối với nấm Penicillium
spp. trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 2 % chitosan CT4: PDA + 3,5 % chitosan
CT2: PDA+ 2,5 % chitosan CT5: PDA + 4 % chitosan
CT3: PDA + 3 % chitosan CT đối chứng: PDA
Thí nghiệm 2: Hiệu quả ức chế của saponin đối với nấm Penicillium spp.
trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 0,5 mg/ml saponin CT4: PDA + 4 mg/ml saponin
CT2: PDA+ 1 mg/ml saponin CT đối chứng: PDA
CT3: PDA + 2 mg/ml saponin
Thí nghiệm 3: Hiệu quả ức chế của muối NaHCO3 đối với nấm
Penicillium spp. trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 2 % NaHCO3 CT4: PDA + 5 % NaHCO3
CT2: PDA+ 3 % NaHCO3 CT đối chứng: PDA
CT3: PDA + 4 % NaHCO3
Thí nghiệm 4: Hiệu quả ức chế của muối EDTA (4Na) đối với nấm
Penicillium spp. trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 0,01 M EDTA CT4: PDA + 0,04 M EDTA
CT2: PDA+ 0,02 M EDTA CT đối chứng: PDA
- Lượng EDTA cần sử dụng được tính theo cơng thức:
CM x M x V Trong đó: V - thể tích cần pha (ml) m= x 100 m- khối lượng cần cân (g) 1000 M- Khối lượng mol (g/mol)
CM – nồng độ mol (mol/L) - Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần.
- Địa điểm thực hiện: phịng thí nghiệm bộ mơn bệnh cây, khoa Nơng học. - Thời gian thực hiện: từ tháng 10 – 12/2016.
- Đánh giá hiệu quả các vật liệu, hoạt chất: đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày sau cấy và đánh giá hiệu quả ức chế nấm.
3.4.4.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Chuẩn bị dung dịch lây nhiễm:
- Sau khi nguồn P.digitutum và P. italicum được nuôi cấy trên môi trường
PDA (potato dextrose agar) trong vịng 7 ngày thì được sủ dụng để làm dung dịch lây bệnh.
- Trong ống nghiệm vô trùng, bào tử được cho vào ống nghiệm với 100 ml nước vô trùng. Lắc mạnh trong 5 phút để bào từ phân tán đều ra dung dịch nước cất. Kiểm tra nồng độ bào tử trong dung dịch bằng buồng đếm bào tử cho đến khi đạt 105 bào tử/ml là được.
Chuẩn bị quả để lây nhiễm nhân tạo:
- Lây nhiễm nhân tạo: quả cây có múi được sử dụng cho thí nghiệm đảm bảo sạch bệnh, đồng đều về màu sắc, kích thước, khơng bị sây sát, thối hỏng. Quả được rửa sạch bằng nước cất sau đó xịt cồn 70o và để khơ trong điều kiện phịng thí nghiệm. Lây nhiễm nhân tạo bằng cách tạo 4 vết thương sâu khoảng 2 mm phân bố đều trên bề mặt quả. 1ml dung dịch bào tử đã được chuẩn bị tiêm vào mỗi vết thương sau đó quả được giữ trong vòng 2 h rồi tiến hành bước tiếp theo.
3.4.4.3. Thí nghiệm phịng trừ bệnh sau thu hoạch
- Dựa vào kết quả thí nghiệm invitro để lựa chọn nồng độ thích hợp có hiệu quả ức chế nấm cao tiến hành thí nghiệm xử lý mẫu quả.
- Quả được thu hái tại vườn với độ đồng đều về độ chín, kích thước, khơng bị sây sát, không biểu hiện triệu chứng bệnh. Rửa sạch quả bằng nước. Nhúng quả trong cồn 70o trong 1 phút. Để khô quả trong điều kiện phòng.
- Lây nhiễm nhân tạo với tác nhân gây thối quả theo cách đã nêu ở trên. - Xử lý các mẫu quả bằng một số hoạt chất hóa học và sinh học như chitosan, saponin, muối EDTA, NaHCO3 và công thức đối chứng không xử lý.
- Một số thử nghiệm phịng trừ được bố trí như sau:
+ Quả được lây nhiễm nhân tạo bằng 20 µL dung dịch bào tử nấm
P.itatlicum và P.digitatum nồng độ 106 bào tử/ml (E. Wuryatmo et al., 2014) sau 2h thì xử lý bằng các hóa chất: EDTA 0,04 M, saponin 2 mg/ml, chitosan 2 %, NaHCO3 3%.
+ Quả không lây nhiễm nhân tạo xử lý bằng các hóa chất: EDTA 0,04 M, saponin 2 mg/ml, chitosan 2 %, NaHCO3 3 % sau 1 ngày phun dung dịch bào tử lên quả.
+ Quả trong các thí nghiệm được bảo quản trong các túi nilon và bảo quản trong nhiệt độ phòng 25 oC.
- Theo dõi và đánh giá hiệu quả của vật liệu, chế phẩm dựa trên đánh giá tỷ lệ bệnh %, thời gian tiềm dục, hiệu lực ức chế trên quả sau khi xử lý.
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn trong phịng thí nghiệm với 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 4 vết bệnh mỗi cơng thức. Đối với thí nghiệm phịng, trừ bệnh quả được theo dõi trong vòng 7 ngày sau xử lý. Thí nghiệm thời gian bảo quản quả sẽ được bảo quản trong vòng 4 tuần.
3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 3.5.1. Chỉ tiêu theo dõi 3.5.1. Chỉ tiêu theo dõi
Tổng số quả bị bệnh
- Tỷ lệ bệnh (%) = x 100
Tổng số quả điều tra - Hiệu lực phòng trừ theo Abbott:
C - T
HL (%) = ------------* 100% C
Trong đó: + HL là hiệu lực phòng trừ (%);
+ C là tỉ lệ bệnh của cơng thức đối chứng sau phịng trừ; + T là tỉ lệ bệnh của cơng thức xử lý sau phịng trừ;
3.5.2. Phân tích số liệu
Số liệu thu được sẽ được xử lý theo chương trình thống kê sinh học EXCEL và IRRISTAT 4.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH NHIỄM BỆNH MỐC XANH, MỐC LỤC HẠI CAM QUÝT DO NẤM PENICILLIUM SPP GÂY RA TẠI MỘT SỐ CHỢ TẠI QUÝT DO NẤM PENICILLIUM SPP GÂY RA TẠI MỘT SỐ CHỢ TẠI
HÀ NỘI
4.1.1. Các triệu chứng của bệnh mốc lục (Penicillium digitatum) và mốc xanh (Penicillium italicum) trên trái cây họ cam quýt (Penicillium italicum) trên trái cây họ cam quýt
Triệu chứng ban đầu của bệnh mốc lục tương tự như mốc xanh. Vết bệnh ban đầu là chấm nhỏ hơi ướt, sau đó vết bệnh phát triển, mơ bệnh mềm hơn, chảy nước, vết bệnh biến màu vàng nâu. Các vết bệnh thối lan nhanh và có thể thối đến các múi bên trong quả. Sợi nấm màu trắng xuất hiện trên bề mặt vỏ. Sau khi vết bệnh đạt đến đường kính khoảng 2,5 cm, bào tử màu xanh ô liu (mốc lục) hoặc bào tử màu xanh lam (mốc xanh) được sản sinh, chỉ để lại một vân trắng hẹp của sợi nấm và làm mềm vỏ xung quanh vùng bị tổn thương. Các bào tử màu xanh bao phủ phần quả bị bệnh có thể trở thành màu nâu ơ liu khi già. Nếu độ ẩm tương đối thấp, toàn bộ trái cây co lại nhăn, khô. Nếu độ ẩm tương đối cao, nấm mốc và các vi khuẩn khác tham gia và quả thối mềm, phân hủy hàng loạt.