1.5.1 .Giới thiệu một số loài vi khuẩn
1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
1.5.2.1. Phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên
môi trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC. đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải
100μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có
thành các nồng độ theo yêu cầu. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10μg/ml, Tetracyclin 30 μg/ml, Amoxilin 10μg/ml); đối chứng âm là DMSO. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật
bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d =
đường kính lỗ khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung
bình.
1.5.2.2. Xác định nồng độức chế tối thiểu
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimum inhibitory concentration) là thuật ngữ chỉ nồng độ tối thiểu của dung dịch thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
MIC được sử dụng trong các thử nghiệm đánh giá độ nhạy cảm của dịch thử.
Phương pháp môi trường lỏng
Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dung dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi
trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
Nguyên tắc: Dung dịch thử được pha loãng theo cấp độ giảm 1⁄(2 )trong môi
trường nước thịt. Huyền dịch vi khuẩn được pha loãng tới mật độ xác định và được nuôi với thời gian, nhiệt độ thích hợp cùng với sự hiện diện của kháng sinh trong môi
trường nước thịt. Với nồng độ thấp nhất của kháng sinh khi không thấy sự phát triển của vi khuẩn (trong như ban đầu) được ghi nhận là giá trị MIC của dung dịch thử đó
trên chủng vi khuẩn đó.
Cách thực hiện: Cho vào ống nghiệm thứ nhất a ml dung dịch thử, thêm đồng
thể tích (a mL) dung dịch môi trường (pha loãng gấp 2 lần). Từ ống thứ nhất lắc đều lấy a mL chuyển sang ống thứ hai đã có a mL môi trường (pha loãng gấp 4), cứ tiếp tục sang các ống nghiệm sau cho hết các ống đã định, cuối cùng lấy a mL dung dịch ở ống cuối bỏđi. Như vậy ta có một dãy đã pha loãng dần. Một ống làm chứng thì chứa
a mL môi trường, thêm vào mỗi ống một lượng hỗn dịch vi khuẩn như nhau rồi để tất cả trong tủ ấm trong một thời gian thích hợp. Nếu với mục đích định lượng thì tiến hành song song với một dãy ống khác có những nồng độđã biết của chất kháng khuẩn. Muốn đánh giá kết quả ta đọc độ pha loãng lớn nhất mà vi khuẩn không mọc được. Muốn biết với độ pha loãng đó vi khuẩn bị diệt hay chỉ bị kìm hãm thì từ ống có độ pha loãng đó ta lấy một phần và chuyển vào một ống nghiệm khác có chứa môi trường
vô trùng. Nếu sau khi ở tủấm mà vi khuẩn mọc tức là kìm hãm, nếu vi khuẩn không mọc tức là diệt.
Phương pháp môi trường đặc
Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dung dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi
trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).
Nguyên tắc: Dung dịch thửđược pha loãng trong môi trường thạch theo cấp độ
giảm ½. Vi khuẩn được cấy trên đĩa kháng sinh và được ủấm cho phát triển. Nồng độ
thấp nhất khi quan sát bằng mắt thường với khuẩn lạc ≤ 3 được xác định là giá trị
MIC.