1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn
1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn
Chúng tôi nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau (100; 200; 400; 800 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba chủng Gram âm (Escherichia coli (E.coli) – ATCC 43895, Salmonella typhi - ATCC 14028,
Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus
aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005).
1.5.1.1. Escherichia coli
Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá
trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí
sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình
nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học.
Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề
"Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung". Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Division): Proteobacteria Lớp (Class): Gammaproteobacteria Bộ (Order): Enterobacteriales Họ (Family): Enterobacteriaceae Giống (Genus): Escherichia
Loài (Species): E.coli
Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi
khuẩn có hình roi thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu
nóng. Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ. Các chủng gây bệnh được phân loại bởi cơ chế sinh bệnh đặc biệt như các độ tố chẳng hạn.
Hình 1. 8: Vi khuẩn Escherichia colidưới kính hiển vi
Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn
E.coli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể
di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng không thể tạo bào tửnhư nhiều loại vi khuẩn khác.
Sinh trưởng ở 15 – 40 ℃ nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37 ℃, pH từ 6,4 –
7,4. Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc
tròn, ướt, trắng đục khoảng 2 – 3mm.
Tính chất sinh hóa và đề kháng:
- Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic.
- Hầu hết các loại vi khuẩn E.coliđều có khảnăng nitrat thành nitrit, sinh hơi.
- Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 100 ℃ trong 2 giờ. - Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
- Bị hủy bởi formol 5%.
- Rất độc, chỉ cần 0,05 mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ.
Độc tố:
Một số E. coli sản sinh ra độc tốcó tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể
dẫn đến bệnh nặng. Các E. coli sản sinh ra độc tố Shiga này đôi khi được gọi là STEC (phát âm là "S-TECK").
Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm
hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏvà người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng.
Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác
1.5.1.2. Bacillus cereus
Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng
hình ovan, có khảnăng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc
thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng
độc thực phẩm do Bacillus cereusđược phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.
Theo phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Bacillaceae Giống (Genus): Bacillus
Loài (Species): Bacillus cereus
Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5 – 1,5 x 2 – 4 µ. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khảnăng di động.
Hình 1. 9: Vi khuẩn Bacillus cereusdưới kính hiển vi
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức
ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộđộc thực phẩm.
Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở
nhiệt độ thích hợp 5 – 50 oC, tối ưu 35 – 40 oC, độ ph 4,5 - 9,3; thích hợp 7 - 7,2.
- Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
- Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
- Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng.
- Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn.
Tính chất sinh hóa:
Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol.
- Khử nitrat thành nitrit. - Phản ứng VP (+). - Phân giải Tyroxin. - Catalase (+), Citrate (+).
- Mọc trên NB + 0,001% lyzozym.
Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rauquả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm
nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh
nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
1.5.1.3. Salmonella
Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loài vi rút gây ra và đã xác định
Salmonella cholerasuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.
Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacilus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là
Salmonella enteritidis.
Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Proteobacteria
Lớp (Class): Gammaproteobacteria
Bộ (Order): Enterobacteriales
Họ (Family): Enterobacteriaceae
Giống (Genus): Salmonella lignieres 1900
Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi,
không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính
khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Phát
triển tốt ở 6 ℃– 42 ℃, thích hợp nhất là 35 ℃– 37 ℃, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất là 7,2 , ở nhiệt độ18 ℃ –40 ℃ vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. Trên môi trường phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường chuyển sang màu vàng.
Hình 1. 10: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi
Tính chất sinh hóa và đề kháng:
- Lên men đường manit, sorbitol (+).
- Không lên men đường lactose, sucrose, salicin, inositol (-).
Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố:
Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tốở ruột gây
độc thần kinh, hôn mê, co giật.
Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố
thần kinh và ruột.
1.5.1.4. Staphylococcus aureus
Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày
tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,
phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳđầu của lịch sử ngành vi sinh vật học. Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Eubacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Staphylococcaceae Giống (Genus): Staphylococcus
Loài (Species): Staphylococcus aureus
Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các
cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và
thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ.
Một sốStaphylococcusđược tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.
Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò
trong y học: Staphylococcus aureus (S. aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh.
o Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da).
o Staphylococcus saprophyticus.
Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không
thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh
trưởng tối ưu của S. aureus là 18 – 40 ℃, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 ℃, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu
vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S.
aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn
khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao.
Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt
độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35 – 37 ℃.
Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống
ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus
(SA) xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác.
Tính chất sinh hoá và đề kháng:
Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu
vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.
S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành
nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S.
Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta –
lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh
như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất
tác dụng.
Ngoài ra, tụ cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn
Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng
thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn.
Cấu trúc kháng nguyên:
Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở
vách tế bào.
Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề mặt. Người ta có thểcăn cứvào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn.
Độc tố - Enzym:
Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khảnăng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm
Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi
trường có nhiệt độ trên 15 ℃hơn cả vi khuẩn.
Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S.aureus là một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 ℃ và có thể tồn tại nhiệt ở 100 ℃ trong vòng 30 – 700 phút.
Các enzyme ngoại bào:
- Protease phân giải protein của tế bào chủ. - Lipase phân giải lipid.
- Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME).
1.5.1.5. Pseudomonas aeruginosa
Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống
Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và
loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan nhiều đến y học.
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng
riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực. Có pili, không bào tử.
Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Proteobacteria
Lớp (Class): Gamma proteobacteria
Bộ (Order): Pseudomonadales
Họ (Family): Pseudomonas
Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa
Sức đề kháng:
Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá. Có khảnăng đề kháng kháng sinh cao.
Kháng nguyên:
Kháng nguyên liên kết với tế bào:
+ Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thểđặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh.
+ Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những
chủng P. aeruginosa có khuẩn lạc dạng M và dạng R.
Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử
dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch.
Phân loại trực khuẩn mủ xanh:
Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự
phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế
tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa.
Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch
tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95% số chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định type
kháng nguyên O (serotype) chia P. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký
hiệu từO1 đến O16 (hoặc P1 đến P16).
Nội độc tố:
Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS
đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết.
Ngoại độc tố:
Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động
tượng tựnhư cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khảnăng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức
năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A
nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng.
1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn