CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis
2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Áp dụng phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số theo TCVN 9745-1-2013 (ISO 14502-1-2005) [8] chúng tôi hiệu chỉnh phương pháp cho phù hợp với nghiên cứu như sau:
Mẫu chè khô (2 g) đã nghiền nhỏ (độ ẩm 5%, kích thước 0,5-1mm) được cho vào bình chiết 100 ml. Chiết trong dung môi ethanol với thời gian, nồng độ, tỉ lệ khảo sát. Sau khi trích ly, làm nguội tự nhiên xuống nhiệt độ phòng và lọc lấy phần dịch chiết. Hút chính xác 1 ml dịch chiết vào bình định mức 100 ml và lên thể tích tới vạch,
lắc đều thu được dịch pha loãng. Tiến hành so màu theo trình tự: hút 1 ml dịch chiết pha loãng, thêm 5 ml thuốc thử Folin Ciocalteu 10% và lắc đều, tiếp tục thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5%, lắc đều và để yên 1h sau đó tiến hành so màu ở bước sóng 765 nm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng polyphenol tổng số theo % chất khô được tính dựa vào đường chuẩn của gallic acid trong khoảng nồng độ 10 -50 µg/ml theo công thức:
wT = (DmSchuẫu - Dgiao điểm) x Vmẫu x d x 100
ẩn x mmẫu x 10 000 x wDM,mẫu
Trong đó
Dmẫu là mật độquang thu được đối với dung dịch mẫu thử;
Dgiao điểm là mật độ quang tại điểm đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất cắt với trục y;
Schuẩn là độ dốc thu được từ hiệu chuẩn tuyến tính phù hợp nhất;
mmẫu là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
Vmẫu là thể tích của dịch chiết mẫu (50 ml đối với chè hòa tan và 10 ml
đối với chè), tính bằng mililit (ml);
d là hệ sốpha loãng được dùng trước khi xác định phép đo màu (điển hình từ 1,0 ml đến 100 ml, vì vậy hệ số pha loãng là 100);
wDM,mẫu là hàm lượng chất khô của mẫu thử, xác định được theo 8.2, tính bằng phần trăm khối lượng (%).
2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic
Áp dụng TCVN 9745-1-2013 (ISO 14502-1-2005) [8] chúng tôi xây dựng
phương trình đường chuẩn như sau:
Dùng pipet chuyển 1,0 ml dung dịch chuẩn axit gallic tương ứng với khoảng 10 µg, 20 µg, 30 µg, 40 µg và 50 µg axit gallic khan vào các ống nghiệm, thêm 5,0 ml thuốc thử Folin Ciocalteu 10% và lắc đều, tiếp tục thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5%,
lắc đều và đểyên 1h sau đó đo mật độ quang trong cuvet có chiều dài đường quang 10
mm so với nước trên máy đo quang phổđặt ởbước sóng 765 nm.
Dựng đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất từ khối lượng của axit gallic khan trong các chất chuẩn.
Với X: Hàm lượng của axit gallic khan, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml) Y: Mật độ quang, 765 nm