CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.4. Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè
2.4.1. Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử
a) Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid Phản ứng Borntraeger Thực nghiệm: Cao Chiết Lá chè Dịch Chiết Lá chè Dịch (Pha nước) Dịch Eyl axetat Hoạt tính sinh học ạ HPLC Cao Khảo sát nhiệt độ sấy
Cho erlen chứa các dung dịch sau: - Dịch ethanol 1 ml
- HCl 4N 4 ml - FeCl3 20% 4 ml - Dịch lá chè 4 ml
Đun cách thuỷ trong 10 phút, để nguội và cho vào bình gạn dung tích 50 ml.
Lắc với 5 ml ether. Gạn bỏnước. Lớp ether được giữ lại để thực hiện phản ứng.
Lấy 1 ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm từ từ từng giọt đến hết 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
Dung dịch lớp kiềm có màu đỏ sim.
b) Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:
Thuốc thử Liebermann – Burchard:
• Anhidrid acetic 1 ml
• H2SO4 đậm đặc Dung dịch màu xanh lục.
Thuốc thử Salkowski: H2SO4đậm đặc.
Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm.
Dung dịch màu xanh tím.
c) Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid Thuốc thử Wagner:
• I2 1,27g
• KI 2g
• H2O vừa đủ 100 ml
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên.
Có xuất hiện tủa màu nâu.
d) Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid Một số thuốc thử Flavnoid:
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ
từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát. Dung dịch màu xanh đen.
Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến
xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt
đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.
Dung dịch màu vàng cam.
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khảnăng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
- Thuốc thử: HCl 0,1N NaOH 0,1N
- Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử. - Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
- Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau,
có thể có saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.
2.4.2. Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng với bản mỏng silicagel (Merck) tráng sẵn: Hệ dung môi khai triển:
Cloroform: Methanol: Axit axetic (9: 3: 3)[139]
Nhận dạng bởi Iốt: được giữ trong buồng Iốt trong vài phút.
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ởbước sóng 254 nm.
2.4.3. Định tính bằng UV-VIS
Chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp phụ phân tử và bước sóng cực đại của dịch chiết lá chè theo TCVN 9745-1:2013, và gửi mẫu tới VIỆN Y TẾ CÔNG CỘNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH (Địa chỉ: 159 Hưng Phú, Phường 8, Quận 8, Thành Phố
Phép đo quang được thực hiện trên máy quang phổ UV VIS 1700 PC (Nhật Bản) có kết nối máy tính với các điều kiện đonhư sau:
Phạm vi bước sóng (nm): 300-1000
Cuvet thạch anh chiều dày 1cm Tốc độ quét: Trung bình Khoảng lấy mẫu: 0.5
2.4.4. Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC
Cao chiết lá Chè được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được mẫu ở dạng cao gửi mẫu rắn này đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí
Minh) để định lượng các hợp chất polyphenol sau: Epigallocatechingallate (EGCG), Epicatechingallate (ECG), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin (EC).
Hình 2. 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao