CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ
Theo nguyên tắc, làm việc trên 1 yếu tố thí nghiệm còn cố định các yếu tố còn lại, kết quả tốt nhất của thí nghiệm trước được rút ra làm thông số cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Chỉ tiêu đánh giá là hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết (tiến hành phản ứng và phép đo quang phổ theo TCVN 9745-1-2013).
Từ các công trình nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành chiết tách polyphenol bằng dung môi ethanol theo quy trình được trình bày ởsơ đồ (2.1) như sau:
Rửa, diệt enzym, Nghiền nhỏ Nồng độ dung môi Thời gian chiết Khảo sát các điều kiện chiết Tỉ lệ NL:DM Nhiệt độ PH Cô quay
Sấy thăng hoa
Lá chè Định tính Thuốc thử và TLC Cao chiết lá chè Dịch chiết lá chè Xác định hàm lượng polyphenol tổng Bột chè Ứng dụng Bột chiết lá chè
Quy trình được thực hiện các bước cụ thểnhư sau:
- Bước 1: Thu hái lá chè xanh trực tiếp tại vườn, xửlý thu được bột chè có độẩm 3-
5%, kích thước 0,5-1 mm.
Hình 2. 1: Lá chè sau khi xử lý
- Bước 2: Tiến hành khảo sát chiết tách polyphenol, tối ưu hóa các yếu tố công nghệ như sau:
a) Ảnh hưởng của nồng độ dung môi
Thí nghiệm được tiến hành với dung môi ethanol, nhiệt độ trích ly: 65 oC, thời gian trích ly 35 phút, trích ly 1 lần, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25.
Nồng độethanol được khảo sát 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 96%. b) Ảnh hưởng của thời gian chiết
Thời gian trích ly được khảo sát trong khoảng từ 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55 phút. c) Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Thí nghiệm được khảo sát với các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:15; 1:20; 1:25; 1:30; 1:40; 1:50; 1:60.
d) Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly
Nhiệt độtrích ly được khảo sát trong khoảng từ 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 0C. e) Ảnh hưởng của pH
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH bằng cách điều chỉnh độ pH bằng axit citric và natri hidro cacbonat. Với mẫu đối chứng là dung môi ethanol chưa có sự điều chỉnh pH có độ pH = 4,3.
Hình 2. 2: Thiết bị chiết tách
- Bước 3: Dịch chiết thu được đo hàm lượng Polyphenol tổng bằng phương pháp
Folin-Denis thu được điều kiện tối ưu.
Hình 2. 3: Mẫu đo UV - VIS
- Bước 4: Dịch chiết thu được mang đi cô quay chân không thu được cao chiết lá
chè ở điều kiện tối ưu để Định tính bằng thuốc thử và Sắc ký lớp mỏng. Thử hoạt tính oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn.
2.3.2. Một số quy trình khảo sát khác
Các polyphenol có nhiệt độ sôi khác nhau nên sau khi khảo sát được các yếu tố
công nghệ và thu được quy trình tối ưu, chúng tôi khảo sát thêm một số yếu tố như
nhiệt độ, số lần chiết nhằm khảo sát sựảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol.
- Mẫu đối chứng: Nồng độ dung môi là 70% v/v; thời gian trích ly 35 phút và nhiệt độ trích ly: 65 0C, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:25 đã được khảo sát ở mục (2.3.1).
- Thí nghiệm 1: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng.
Quy trình chiết: Chiết với điều kiện như mẫu đối chứng, nồng độ dung môi là 70% v/v; thời gian trích ly 35 phút và nhiệt độ trích ly: 65 0C, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:25 nhưng lọc lấy bã và thêm dung môi chiết tiếp tương tự lặp lại 3 lần.
- Thí nghiệm 2: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng.
Nồng độ dung môi là 70% v/v và tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:25. Quy trình chiết theo 2 bước:
Bước 1: chiết trong 60 0C trong 35 phút. Thu được dịch chè, lọc lấy bã, thêm dung môi chiết tiếp bước 2.
Bước 2: thêm dung môi mới, chiết với nhiệt độ 80 0C trong 35 phút. Gộp dịch sau 2 lần chiết đo polyphenol tổng.
- Thí nghiệm 3: Thí nghiệm nhằm khảo sát sựảnh hưởng của chiết với hexan loại
béo đến hàm lượng polyphenol tổng.
Quy trình chiết: Nồng độ dung môi là 70% v/v; thời gian trích ly 35 phút và nhiệt độ trích ly 65 oC, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:25.
Thu được dịch chè, lắc với hexan thu được dịch chè đã tách béo.
2.3.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ
enzym
Mục đích của thí nghiệm này là để kiểm tra việc tách chiết enzyme phenolic chống oxy hóa từ lá chè bằng cách sử dụng các chế phẩm enzyme phân hủy tế bào thực vật thương mại. Việc khai thác các phenol được tối ưu hóa bằng cách thay đổi các thông số tỉ lệ enzym : nguyên liệu trong các thí nghiệm giai đoạn được thiết kế thống
kê. Năng suất của các mẫu được chọn sau đó được so sánh với các mẫu của lá chè không có sự hỗ trợ của enzym.
Mẫu lá chè sau khi xửlý được cho vào Erlen với cái điều kiện đã được tối ưu ở
mục (2. 3.1) Nồng độ Ethanol, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi. Nồng độ pH được điều chỉnh bằng Axit citric và Natri hidro cacbonat.
Hình 2. 5: Mẫu chè được ủ với enzyme
a) Khảo sát với enzym cenlulozo
Enzym cellulase được thêm vào erlen có tỉ lệ khác nhau. Nồng độ enzyme đã
được thay đổi giữa 0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5% v/w, và ủ trong bểđiều nhiệt ở 50 °C trong 60 phút ở pH 5,5.
b) Khảo sát với enzym pectinase
Enzym pectinase được thêm vào erlen có tỉ lệ khác nhau. Nồng độenzyme đã được thay đổi giữa 0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5% v / w, và ủở 40 °C trong 60 phút ở
pH 4,5.
2.3.4. Ảnh hưởng của độẩm và độ già của lá
Độ non già của lá cũng ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol tổng, lá càng non
hàm lượng polyphenol càng lớn, tuy nhiên nụ lá và các lá 1; 2 thường được thu hái với mục đích thương mại. Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát trên các loại lá: Lá tươi, nụ
lá, lá già với loại lá 2; 3; 4 đã tối ưu thu được ở mục (2. 3.1) nhằm so sánh sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng. Các thí nghiệm được thực hiện dựa trên các thông số đã được ở mục (2. 3.1).
2.3.5. Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè
Sau khi tối ưu hóa quy trình và chọn được các thông số công nghệ tối ưu, chúng
tôi tiến hành tinh chế dịch chiết thu được nhằm loại các chất không mong muốn như
Clorofom, etyl axetat. Dựa vào quy trình của Row và Jin, chúng tôi hiệu chỉnh quy trình cho phù hợp được trình bày trên sơ đồ sau:
Cô quay
Chiết với Clorofom/Nước Chiết với Etyl axetat
Cô quay
Quy trình tinh chếđược sử dụng theo đề xuất của Row và Jin [108] có hiệu chỉnh.
Theo đó, dịch chiết polyphenol sau cô quay chân không sẽ được thu hồi cồn. Sau đó,
bổ sung vào dịch trích ly (trong nước) một lượng nước tương đương với lượng cồn thu hồi, rồi đem trích ly bằng dichloromethane để loại bỏ caffeine và các chất màu. Loại bỏ lớp dưới (dung dịch trong dichloromethane), phần lớp trên (dung dịch trong nước) sẽđược trích ly lại bằng ethyl acetate. Loại bỏ lớp nước, dung dịch trong ethyl acetate
được thu hồi dung môi bằng cô quay chân không. Sản phẩm thu được sau cô đuổi
dung môi được làm khô bằng cô quay chân không và định lượng bằng HPLC.