CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.5. Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè
2.5.1. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè
Lực kháng oxy hoá tổng của các mẫu khảo sát dịch chiết lá chè được đánh giá theo phương pháp phospho molybdenum của Prieto[56] có hiệu chỉnh cho phù hợp với
mục đích nghiên cứu như sau:
Một lượng 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 10𝜇g/ml chứa một loại chất khử (trong
nước, metanol, ethanol, dimethyl sulfoxide hoặc hexane) đã được kết hợp trong một
ống Eppendorf với 3 ml dung dịch thuốc thử (axit sulfuric 0,6 M; natri phosphat 28 mM; và 4 mM amoni molybdate). Các ống được đậy nắp và ủ trong bểđiều nhiệt ở ở
của dung dịch nước của từng mẫu được đo ở 695 nm so với mẫu trắng. Trong mẫu trắng, dung dịch cần phân tích được thay bằng nước cất. Lực kháng oxy hoá tổng được biểu diễn theo độ hấp thụ của mẫu, mật độ quang càng lớn thì dung dịch càng có tính oxy hóa mạnh. Acid gallic được sử dụng làm chất so sánh.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số sau:
- Nồng độ dịch chiết tăng dần 10μg/ml; 20μg/ml; 30μg/ml nhằm khảo sát ảnh
hưởng của nồng độ dịch chiết đến khảnăng kháng oxy hóa.
- Ảnh hưởng của quá trình tách béo bằng hexan đến khảnăng kháng oxy hóa.
- Ảnh hưởng của quá trình tinh chế và thời gian lưu mẫu đến khả năng kháng oxy
hóa.
Hình 2. 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá
2.5.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
a) Chuẩn bị giống
Bảo quản giống: vi khuẩn sau khi lấy về sẽđược cấy ria trên môi trường thạch
dinh dưỡng TSB, đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc
đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Môi trường trởnên đục do có sựtăng sinh của vi sinh vật.
Tăng sinh: Để hoạt hóa vi khuẩn tiến hành tăng sinh với 3 ml môi trường TSB cho 40 gl dịch vi khuẩn rồi 10 ml môi trường với 0,5 ml dịch và 100 ml môi trường
với 1 ml dịch, ở mỗi giai đoạn này đều ủ ở 37 oC trong 100 rpm từ 10 - 12 giờ. Thực
rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vậtbằng 3 lần nước cất vô trùng và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0,5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng trong các khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
b) Chuẩn bị pha cao Lá chè ở các nồng độ khác nhau
Cao Lá chè được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với các nồng độ 800, 400 và 200, 100 mg/ml. Cao với các nồng độ khác nhau sau đó được cho lên khoanh giấy (đường kính 6 mm) vô trùng. Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng là
ampicillin và tetracycline (1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch
DMSO 5% vô trùng.
Hình 2. 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn
c) Phương pháp xác định hoạt tính kháng
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000). Theo đó, hoạt
tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo đường kínhvòng ức chế
vi sinh vật (ĐK) theo công thức ĐK (mm) = D - d với D là đường kính vòng vô khuẩn
và d là đường kính khoanh giấy kháng. Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
ĐK (mm) = D - d với
D là đường kính vòng vô khuẩn d là đường kính khoanh giấy kháng. Cách tiến hành:
Bước 1: Tăng sinh VSV từ ống gốc sang môi trường lỏng MP. Thời gian 12
–24 giờ, điều kiện nhiệt độ 37 ℃. Cách tiến hành: nhỏ từ ống gốc 1 – 2 giọt
sang ống môi trường MP.
Bước 2: Cấy trên môi trường thạch MP hoặc MHA hoặc môi trường phân
lập
Bước 3: Chọn 2-3 khuẩn lạc đẹp cấy vào môi trường lỏng TSB. Thời gian 12
–24 giờ.
Bước 4: Ly tâm ống VSV của môi trường TSB sau nuôi cấy 24 giờ, bỏ phần
nước ở trên, sau đó cho nước cất đã khử trùng vào. So sánh với ống nghiệm
này với ống độ đục McFarland đã chuẩn bị.
Bước 5: Nếu xác định vòng kháng khuẩn thì hút 100 l cấy trang lên môi
trường thạch MHA, để khô, cho đĩa giấy 6 mm vào theo nồng độ pha loãng
khác nhau. Kháng dương dùng kháng sinh tetracylin và ampicillin nồng độ
10 g/ml.
Bước 6: Nếu xác định chỉ số MIC, thì hút 20 l (100l) vi sinh vật cho vào
ống nghiệm chứa 5 ml môi trường MHB và cho vào các ống nghiệm 5 ml nồng độ cao pha loãng khác nhau.
Bước 7: Nuôi cấy trong điều kiện 37 ℃, sau 12 – 24 giờ lấy ra quan sát và
xác định vòng kháng khuẩn, chỉ số MIC (ống nghiệm không đục).
c) Xử lý số liệu
Kết quả vòng kháng khuẩn đo được sẽ được tính từ trung bình của các lần lặp lại.