Qua kết quả phổ HPLC ta thấy có xuất hiện 15 hợp chất trong đó định danh
được 4 chợp chất là EGC (Epigallocatechine), EC (Epicatechin), EGCG (Epigallocatechingallate ) và ECG (Epicatechingallate), và định lượng được 2 hợp chất
là EGCG (118,54 mg/g) và EC (15,09mg/g). Qua đó ta thấy quá trình tinh chế cao chiết thu được cao polyphenol khá tinh khiết, lẫn tạp chất không đáng kể.
3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè
3.8.1. Kết quả hoạt tính oxy hóa
Tsai và cộng sự[123]đã nhận thấy rằng trong tất cả các thử nghiệm, lá chè có hoatj tính kháng oxy hóa mạnh nhất, nên chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính oxy
hóa trên 4 loại lá: lá chè, lá lô hội, lá neem, lá xoài, thu được kết quảđo mật độ quang như trình bày ở bảng 3.19. Bảng 3. 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ Một số loại lá Mật độ quang Lá Chè xanh 3,10 Lá Lô hội 0,46 Lá Neem 0,31 Lá Xoài 0,14
Hình 3. 19: Biểu đồ khảnăng oxy hoá các loại lá
Từ kết quả trên ta thấy trong các loại lá, độ hấp thụ quang ở nồng độ 10 𝜇g/ml
của cao lá Chè xanh cao nên lực kháng oxy hóa của cao lá Chè xanh vượt trội so với các lá còn lại, cao gấp 22,1 lần lá xoài, gấp 10 lần lá neem, gấp 6,74 lần lá lô hội.
Bảng 3. 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ
Mẫu Nồng độ Mật độ quang
Mẫu trước tinh chế 10 μg/ml 3,42
Mẫu trước tinh chế 20 μg/ml 3,80
Mẫu trước tinh chế 30 μg/ml 4,50
Mẫu táchbéo bằng hexan 10 μg/ml 3,03
Mẫu sau tinh chế (Đo ngay) 10 μg/ml 3,10
Mẫu sau tinh chế(Lưu mẫu 2 ngày) 10 μg/ml 2,90
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
Lá Chè xanh Lá Lô hội Lá Neem Lá Xoài
Độ hấp
Hình 3. 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ
Kết quả cho thấy tính oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ cao chiết, nồng độ càng
tăng, tính oxy hóa càng tăng. Mẫu sau khi tinh chếcó tính oxy hóa kém hơn mẫu trước
khi tinh chế, mẫu sau chiết để 2 ngày có tính oxy hóa kém hơn mẫu mới, nguyên nhân
có thể là mẫu sau khi tinh chế hoặc để lâu tiếp xúc với không khí và ánh sáng, bị oxy hóa làm giảm hàm lượng polyphenol tổng.
Mẫu tách béo bằng hexan có tính oxy hóa kém hơn mẫu không tách béo, như vậy
quá trình tách béo cũng làm ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol tổng.
3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Chúng tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 5 loại vi khuẩn: E.coli; B.
cereus; S. typhi; P.aeruginosa; S. aureus. Kết quả bảng 3.21 trình bày đường kính
vòng kháng khuẩn của 5 loại vi khuẩn trên, khảnăng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiên qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri, đường kính càng lớn hoạt tính kháng khuẩn càng cao, vi khuẩn đó hoạt động càng kém.
Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè STT STT Đường kính vòng kháng khuẩn Nồng…… D (mm) độ ……… (mg/ml)………
E.coli B. cereus S. typhi P. aeruginosa S. aureus
1 Dịch chè 800 7,0 8,0 6,0 6,5 6,7 2 Dịch chè 400 6,5 7,5 4,0 6,0 4,0 3 Dịch chè 200 5,3 6,0 4,0 4,0 4,0 4 Dịch chè 100 5,3 5,0 4,0 3,0 3,5 5 Chloramphenicol 13 15 13 14 12 6 Tetracycline 7,3 8,0 6,0 4,0 4,3
Từ kết quả cho thấy nồng độ dịch chè càng giảm, đường kính kháng khuẩn càng giảm, khi pha loãng nồng độ dịch chè tới nồng độ 100 mg/ml thì vẫn thấy đường kính vòng kháng ở cả 5 loại vi khuẩn tức là khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá chè rất cao dù nồng độ cao chiết chè rất thấp. Các vòng kháng đều rất to, rõ ràng và có sự
chênh lệch ít.
Hình 3. 22: Khảnăng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè Chú thích: 1: 800 mg/ml Chú thích: 1: 800 mg/ml 2: 400 mg/ml 3: 200 mg/ml 4: 100 mg/ml 5: chứng (+) tetracyline 6: chứng (+) Ampicyline7: chứng (-) DMSO 5%
Trên chủng E.coli khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm nhẹ từ nồng độ
800 mg/ml và 400 mg/ml là 7 mm và 6,5 mm. Khi giảm nồng độ còn 200 mg/ml và 100 mg/ml thì đường kính kháng khuẩn không thay đổi là 5,3 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè đối với chủng E.coli tương đối ổn định, dù giảm nồng độ xuống thấp 100 mg/ml thì vẫn có khảnăng kháng.
Trên chủng vi khuẩn B.cereus khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự
giảm nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml - 100 mg/ml là 8 mm xuống 5 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch lá chè đối với chủng giảm dần theo chiều giảm nồng độ cao chiết lá chè.
Trên chủng vi khuẩn S.typhi khi khảo sát ở nồng độ 800 mg/ml thì đường kính
vòng kháng là 6 mm, sau đó giảm còn 4mm và không thay đổi dù giảm xuống các
nồng độ 200mg/ml, 100mg/ml.
Trên chủng P.aeruginosa khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml - 100 mg/ml là 6,5 mm xuống 3 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch lá chè đối với chủng giảm dần theo chiều giảm nồng độ cao chiết lá chè
Trên chủng S.aureus khi tiến hành khảo sát với 4 nồng độ trên, nhận thấy sự
giảm mạnh từ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml là 6,7 mm xuống 4 mm, sau đó giảm
không đáng kể 4 mm xuống 3.5 mm khi giảm nồng độ từ 400 mg/ml xuống 100 mg/ml.
3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè
3.9.1. Ảnh hưởng của hàm lượng polyphenol tổng theo thời gian lưu mẫu
Các hợp chất thiên nhiên có nhược điểm là không bền theo thời gian, vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian lưu mẫu để kiểm tra xem mẫu có thể bền trong khoảng thời gian nào, sau đây là kết quảthu được:
Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol
Ngày 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18
PP tổng (%) 19.45 18.55 17.54 17.47 17.16 16.81 16.15 15.42 12.92 12.3
Khối lượng cao 11.01 11.3 11.01 10.68 11.04 10.84 11.1 10.98 10.89 10.81
Hình 3. 23: Biểu đồảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol
Từ kết quả cho thấy mẫu cao polyphenol có nồng độ polyphenol tổng giảm nhẹ
từngày 1 đến ngày 8 ( từ 19,45% - 18,55%), giảm mạnh từ ngày 14-16 và thấp nhất ở
ngày thứ 18 (12,3%).
3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao
chiết lá chè
Các sản phẩm ứng dụng thực phẩm, dược mỹ phẩm thường được xử lý ở nhiệt
độ, điều đó làm ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol của chế phẩm, vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện nhiệt độ sấy tới chất lượng cao chiết lá chè. Mẫu đối chứng là mẫu không sấy bằng nhiệt độ cao.
Bảng 3. 23: Ảnh hưởng của nhiệt độđến hàm lượng polyphenol
Nhiệt độ Mẫu đối chứng 90 100 110 120
Pp tổng (%) 20,51 19,23 15,69 15,38 1,41
KL cao (g) 0,42 0,40 0,38 0,35 0,18
Hình 3. 24: Biểu đồảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol
Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ càng cao hàm lượng polyphenol tổng càng giảm, ở nhiệt độ 120 0C hàm lượng polyphenol giảm mạnh còn 1,41% ,vì vậy chúng tôi quyết định sấy thăng hoa cao chiết lá chè nhằm giữ lại các thành phần có lợi cho sức khỏe khác như protein, lipit, gluxit, vitamin, enzyme và hoạt chất sinh học, màu sắc, mùi, vị…v.v
3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè
Sản phẩm sấy thăng hoa cao chiết lá chè giữđược màu và mùi thơm đặc trưng
của lá chè so với sấy ở nhiệt độ cao.
Hình 3. 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa
So sánh hàm lượng polyphenol tổng và tính oxy hóa của bột polyphenol sau khi sấy thăng hoa và cao polyphenol sau khi chiết thu được kết quả sau:
Cao polyphenol Bột sấy thăng hoa
PP tổng (%) 19,45 18,75
Tính oxy hóa 3,025 2,88
Qua bảng kết quả trên ta thấy hàm lượng polyphenol tổng và tính oxy hóa của bột sấy thăng hoa giảm không nhiều so với cao polyphenol (từ 19,45 xuống còn 18,75 và 3,025 xuống còn 2,88) cho thấy tính ổn định của polyphenol trước và sau khi sấy
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa trên 4 loại vi khuẩn
E.coli; B. cereus; S. typhi; P.aeruginosa; S. aureus, kết quảthu được ở bảng sau:
Bảng 3. 24: Hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa
STT Đường kính vòng kháng khuẩn Nồng…… D (mm) độ ……… (mg/ml)………
E.coli B. cereus S. typhi S. aureus
1 Dịch chè 800 7,0 8,0 7,0 7,0 2 Dịch chè 400 6,0 7,0 6,5 6,5 3 Dịch chè 200 5,0 6,0 6,0 6,0 4 Dịch chè 100 3,0 4,0 6,0 5,0 5 Chloramphenicol 11,0 12 13,0 14,0 6 Tetracycline 7,3 8,0 6,0 8,0
Hình 3. 27: Khảnăng kháng 4 chủng vi khuẩn của Bột sấy thăng hoa Chú thích: 1: 800 mg/ml 2: 400 mg/ml 3: 200 mg/ml 4: 100 mg/ml 5: chứng (+) tetracyline 6: chứng (+) Ampicyline7: chứng (-) DMSO 5%
Kết quả thu được cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa vẫn có khảnăng kháng
khuẩn cao so với trước khi sấy thăng hoa dù giảm nồng độ xuống còn 100 mg/ml cho thấy quá trình sấy thăng hoa không làm ảnh hưởng đến khảnăng kháng khuẩn của cao polyphenol trong lá chè.
Từđó ta rút ra kết luận sau: Cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa hàm lượng polyphenol tổng, tính oxy hóa và khả năng kháng khuẩn ổn định cho thấy phương
pháp sấy thăng hoa nhằm bảo quản polyphenol có tính khả thi cao, có thể áp dụng trong thực tế.
3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da
Kem tan dùng ban ngày để bảo vệ da và làm đẹp da đã được tẩy sạch, làm mất lớp dầu trên da để các mỹ phẩm khác dễ dàng bám lên da. Khi sử dụng, kem phải lan
giữ ẩm làm mềm mại da. Chất lượng kem dưỡng da được đánh giá trên các chỉ tiêu cảm quan sau:
Bảng 3. 25: Chỉtiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da
(i) Cảm quan (35%) Trên sản phẩm Dạng và màu tự nhiên của nền Độ phân pha Độ bóng có ánh bạc Độlinh động
Trên đối tượng sử dụng
Độ gây chỉnh da Độ gây mát Độ gây mùi lạ (ii) Định lượng (45%) Trên sản phẩm Độ pH Độ lún kim (mm) Sai biệt độ lún kim (mm) Điểm bắt đầu chảy (oC)
Trên đối tượng sử dụng
Độ tan trên da (giây)
(iii) Tính an toàn cho người sử dụng (10.0%) Gây dịứng cho da
(iv) Tính an toàn cho môi trường (5.0%) (v) Tính tiện dụng (5.0%)
Kem dưỡng da làm từ cao chiết lá chè có màu xanh nhạt nhưng khi bôi lên da
có thể rửa được, màu xanh không bám lâu vào da, kem bôi lên mát và mịn, không kích
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được những kết quảnhư sau: 1. Về mặt lý thuyết
- Tìm hiểu được tình hình trồng trọt, tiêu dùng và thương mại hóa lá chè ở Việt Nam và trên thế giới.
- Tìm hiểu được các công trình nghiên cứu chiết tách polypheno, ưu nhược điểm của các phương pháp chiết tách trong nước và trên thế giới.
- Tìm hiểu về các chủng vi khuẩn, lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp để nghiên cứu. 2. Về mặt thực nghiệm
- Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là:
Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ
chiết 65 oC, thời gian: 35 phút.
- Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần.
Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%. Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41% cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban
đầu của lá chè.
- Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ.
Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn
Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và
Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml).
- Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không
đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng dụng nó trong một sốlĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế.
- Cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa hàm lượng polyphenol tổng, tính oxy hóa và
khả năng kháng khuẩn ổn định cho thấy phương pháp sấy thăng hoa nhằm bảo quản
polyphenol có tính khả thi cao, có thể áp dụng trong thực tế.
- Xây dựng được quy trình điều chếKem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm).
3. Đào tạo và khoa học
- Đềtài này đã được tham gia cuộc thi nghiên cứu khoa học học sinh sinh viên 2018 –
2019.
- Đã được tham dự Triển lãm Khoa học & Công nghệ 2019.
4.2. Kiến nghị
1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè thể hiện ở cả 5 chủng vi khuẩn dù ở
nồng độ thấp, cần nghiên cứu thêm về nồng độ tối thiểu (MIC) khảnăng kháng khuẩn của từng loại khuẩn nhằm ứng dụng cho các sản phẩm như thuốc đánh răng, nước súc miệng ngừa sâu răng, chống viêm khớp răng, khửhơi mồm, thơm hơi thở…
2. Mở rộng nghiên cứu thêm vềảnh hưởng của các điều kiện nhiệt độ, PH, Thời gian.. tới hiệu suất chiết polyphenol có hỗ trợ enzym và hoạt tính sinh học của nó. Điều này cho phép tạo cơ sở dữ liệu tổng quát để sử dụng enzym cho mục đích khai thác các
hợp chất có hoạt tính sinh học cao trong chè và có thể cung cấp một giải pháp thay thế
thân thiện môi trường cho việc chiết dung môi hữu cơ thông thường.
3. Mở rộng nghiên cứu sử dụng chế phẩm polyphenol chè cho Dược Mỹ phẩm như
thực phẩm chức năng, sản phẩm làm đẹp, bánh kẹo…và nghiên cứu chuyển giao cho sản xuất công nghiệp.
4. Hợp chất polyphenol có tính Oxy hóa cao nên dễ bịoxy hóa ngoài môi trường, cần bảo quản nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản các hợp chất polyphenol
đễ dễ dàng vận chuyển và sử dụng.
5. Cao polyphenol sau tinh chế vẫn còn một số tạp chất nên cần nghiên cứu xây dựng quy trình quy trình tinh chế phân tách từng hợp chất polyphenol tinh khiết hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Mai Thanh Nga, Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học,tách chiết hợp chất poliphenol trong cây chè xanh Thái Nguyên, tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ, 80(04): 159-161.
2. Nguyễn Văn Chung và Trương Hương Lan (2007), Nghiên cứu công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh Việt Nam. Trong: các công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm giai đoạn 2001 – 2005, NXB Lao động – Xã hội, tr. 256 – 260.
3. Trần Chí Hải, Nguyễn Tấn Dân, Nguyễn Đình Nam, Lê Thị Hồng Ánh, Mẫn Phan Vãn Mẫn (2016), Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly polyphenol từ lá trà già, Tạp chí KHCN ĐHĐN, 9(106), tr. 69-72.
4. Ngô Hữu Hợp (1983), Hóa sinh chè, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
5. Nguyễn Tiến Lực (2016), Công nghệ chế biến thịt và thủy sản, NXB ĐH Quốc gia