Nguồn: [82], [96]
Từ đó kết luận rằng che bóng vừa phải có thể cải thiện chất lượng và năng suất của chè. Lá ch được trồng trong bóng râm có chứa axit amin cao cụ thể L - theanine cao và tăng cường hương vị êm dịu cho chè [67], [125], [142] nhưng hàm lượng catechin giảm [84].
1.2.2. Cơ c ế si tổ ợp c tec i
Chất lượng và mùi vị đặc trưng của chè là do catechin cùng với caphein và một số axit amin gồm theanine tạo thành. Catechin có nhiều dược lý chống oxi hóa, kháng ung thư, các bệnh kháng mạch và chống viêm nhiễm. hìn chung, cơ chế tác động của catechin là loại bỏ các gốc tự do trong cơ thể và ức chế một số enzym như cytochrome P45 đây là enzyme tham gia vào quá trình khởi phát ung thư. Catechin được tổng hơp thông qua con đường chuyển hóa glucose, bao gồm con đường pentose, shikimate và flavonoid. Một số enzyme xúc tác cho phản ứng sinh tổng hợp catechin là glucose - 6 phosphat dehydrogenase và shi- kimate dehydrogenase. Tuy nhiên các con đường sinh tổng hợp vẫn chưa được biết nhiều. Các nhà khoa học đã cô lập, mô tả đặc tính của nhiều gen liên quan đến sinh tổng hợp cate- chin như: phenylalanine ammonialyase (PAL), chalcone synthase (C S), flavanone 3- hydroxylase (F3H), flavonoid 3p, 5p hydroxylase (F3p5pH), dihydroflavonol reductase (DFR), leuacoanthocyanidin reductase (LAR) [50], [98].
Catechin được tổng hợp thông qua con đường flavonoid (hình 1.16). Trong đó enzyme PAL xúc tác sự khử amin của L - phenyllalanine tạo thành axit cinamic và NH4+ đây là ước đầu tiên trong sinh tổng hợp phenylpropanoid mà cuối cùng là tạo catechin. Enzym chalcone synthase (CHS) là enzyme quan trọng trong con đường flavonoid ở thực vật, xúc tác các phản ứng tạo chalcone [110]. Chalcone isomerase (C I) xúc tác các đồng phân của chal-
Hàm lượng theanine tăng lên ở rễ cây và chuyển thành catechin khi có ánh nắng mặt trời
24
cone để tạo flavanone [104]. Chất này sau đó sẽ chuyển đổi thành đồng vị dihydroflavonol nhờ flavanone 3 - hydroxylase (F3H), flavonoid 3’ - hydroxylase (F3’H), flavonoid 3’5’ - hydroxylase (F3’5’H). Dihydroflavonol tiếp đó chuyển đổi thành leucoanthocyanidin nhờ dihydroflavonol 4 - reductase (DFR). Từ đây sự chuyển hóa chia thành từng nhánh: leuco- anthocyanidin 4 - reductase (LAR) xúc tác leucoanthocyanidin để sản xuất GC, C và một phần leucoanthocyanidin được chuyển đổi thành EGC và EC bởi hoạt tính của synthase an- thocyanidin (ANS) và reductase anthocyanidin (ANR) [113], [135].
Hình 1. 16. Sơ đồ u tr nh sinh tổng hợp catechin
Nguồn: [18], [53] Phenylalanine Axit Cinamic Axit 4-Coumaric Dihydroquercetin 4 – Coumaroyl CoA Flavanone Chalcon PAL Dihydroflavonol Leucoanthocyanidin Catechin Anthocyanidin Epicatechin Dihydromyrice- tin C4H 4CL CHS ANR F3 H F3’5’ H F3’H DFR LAR CH I 3 x Malonyl CoA DFR DFR ANS Anthocyanidin UFGT Con đường tổng hợp phenylpropanoid
25
Ánh sáng là một trong những yếu tố môi trường quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự điều hòa sinh trưởng và phát triển ở tất cả các giai đoạn chu kỳ sống của cây trồng [88]. Sự trao đổi tổng hợp của chất thường hiển thị một nhịp ngày và đêm. Cường độ ánh sáng cao ảnh hưởng đến sự tích lũy các hợp chất có nguồn gốc trong con đường sinh tổng hợp flavonoid [144], [150]. Kinh nghiệm trồng chè cho rằng ánh sáng có thể ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp của catechin, dựa trên thực tế rằng khi che bóng cây chè làm giảm vị chát của chè. Nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự trao đổi chất thứ cấp trong cây ch đã được bắt đầu trong giữa thế kỷ XX và chủ yếu chú ý đến nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp catechin [77], [83], [115], [128], [152]. Trong những năm gần đây, người ta đã chú ý tới nghiên cứu về cấu trúc và sự tiến hóa gen có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp fla- vonoid, các chất chuyển hóa dưới mức tế bào và cấu trúc của enzyme quan trọng [61], [111], [144].
Cơ sở sinh lý học ảnh hưởng của ánh sáng cũng đã được nghiên cứu và thảo luận rằng cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển cũng như sự tổng hợp thành phần các hợp chất hóa học trong cây chè [30], [49]. Các nhóm flavonoid có vai trò bảo vệ trong quá trình sinh tổng hợp mô thực vật. Flavonoid thường tăng để chống lại những tác động từ ên ngoài như: cường độ tia cực tím quá mạnh (UV) [16], [88], hạn hán [144], chống chọi với nhiệt độ môi trường thấp [91] và nhiễm tác nhân gây bệnh. Cơ chế mà ánh sáng bức xạ liên quan quá trình sinh tổng hợp phenylpropanoid đã được chứng minh trong một số loại thực vật [102]. Khi che nắng cho cây chè có thể làm giảm hoặc loại bỏ các chất ức chế quang hợp từ đó cải thiện chất lượng chè. Khi cây chè trồng trong bóng râm, chè có hàm lượng axit amin cao nhưng hàm lượng catechin giảm [77], [84], [115]. Vị dịu ngọt trong chè là do amino axit đặc biệt là L - theanine, trong khi đó catechin và caphein làm cho chè có vị chát. Sản phẩm thứ cấp của theanine có thể là tiền thân cho sự tổng hợp catechin mà rõ ràng nhất là nhóm N - ethyl [36]. Có khả năng nhóm - ethyl đã đi vào chu trình glycolyte và hình thành các malonyl - CoA là tiền thân của catechin [22]. Quá trình hình thành theanine phụ thuộc vào cường độ chiếu sáng, đòi hỏi phải có sự tham gia của ATP như một đồng yếu tố. Sự tổng hợp theanine có liên quan chặt chẽ tới việc hình thành gluta- mine trong cây. Trong quá trình quang hợp sự hình thành catechin trong lá chè có liên quan mật thiết với L - theanine và chlorophyll [53].
Gần đây, catechin và các thành phần của nó đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sự đa dạng của các giống cây chè [69], [106]. Catechin được coi là tổng hợp thông qua
26
phenylpropanoid và con đường sinh tổng hợp flavonoid (như hình 1.17). Sự hình thành của dihydroquercetin và dihydromyricetin, đó là tiền chất của catechin dihydroxylated (EC và ECG) và catechin trihydroxylated (EGC và EGCG) [16]. Vì vậy, tỷ lệ catechin (dihydrox- ylated: trihydroxylated) [(EC + ECG) :( EGC + EGCG)] và tổng catechin có thể là sử dụng như các chỉ số khi nhân giống chè chất lượng cao. ơn nữa, tỷ lệ này cũng cho thấy tổng catechin trong lá ch tăng với thời gian tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và sinh tổng hợp cate- chin phụ thuộc vào môi trường [99]. Tuy nhiên, đến nay ít có kết quả điều tra đã được thực hiện trên cơ di truyền và tác động môi trường trên catechin, đặc biệt là những tác động của khí hậu các yếu tố trong quá trình hình thành lá non như nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí, lượng mưa và thời gian tiếp xúc với ánh sáng mặt trời …vv
Vai trò của catechin được coi là yếu tố bảo vệ thực vật từ tia UV trong ánh sáng mặt trời và việc sản xuất catechin trong lá chè bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự quang hợp dưới tác động của tia UV [99].
1.2.3. Cơ c ế si tổ ợp c lorop ll
Màu sắc - một trong những yếu tố quan trọng nhất để xác định chất lượng của chè nói chung, matcha nói riêng và chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi điều kiện môi trường như lượng mưa, phân ón và ánh sáng. Trong đó ánh sáng là yết tố rất quan trọng, ánh sáng như một nguồn năng lượng quyết định sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, quyết định màu sắc thực vật [18], [108], [145].. Ánh sáng hấp thụ bởi các lạp lục để sản xuất năng lượng thông qua quang hợp. Hệ thống này được điều chỉnh bởi cường độ bức xạ ánh sáng. Khi tiếp xúc với ánh sáng, lạp lục chuyển đến các tế ào để điều chỉnh lượng ánh sáng được hấp thụ. Khi ánh sáng thấp, lục lạp ở vị trí gần phía trên bề mặt của các tế bào hấp thụ ánh sáng cực đại [20]. Kết quả là cây phát triển trong điều kiện ánh sáng thấp, chất diệp lục có nồng độ cao hơn so với những cây phát triển trong ánh sáng đầy đủ. Tác giả cũng nhận thấy rằng cây chè phát triển trong bóng râm, chất diệp lục tăng và hấp thụ ánh sáng trong lục lạp để tối đa hóa ánh sáng hấp thụ [89]. Chất diệp lục tăng cao làm tăng giá trị màu xanh của lá chè và kết quả cho thấy nước chè trích ly từ lá cây chè phát triển trong óng râm có cường độ màu xanh lá cây cao hơn so với dịch chiết từ lá của cây chè không che bóng. Con đường sinh tổng hợp chlorophyll có 4 giai đoạn (hình 1.17)
27
Hình 1. 17. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp chlorophyll
Nguồn: [44]
Trong giai đoạn đầu của quá trình tổng hợp chất diệp lục, bắt đầu amino axit glutamic được chuyển thành axit 5-aminolevulinic (ALA). Phản ứng này liên quan đến cộng hóa trị
Giai đoạn 1 Giai đoạn 2
Giai đoạn 3
Giai đoạn 4
28
trung gian trong đó axit glutamic được gắn vào một phân tử ARN vận chuyển. Hai phân tử ALA sau đó ngưng tụ để tạo thành porphobilinogen (PBG), mà cuối cùng tạo thành các vòng pyrole trong chất diệp lục [69]. Giai đoạn tiếp theo là lắp ráp một cấu trúc porphyrin từ bốn phân tử của PBG. Giai đoạn này bao gồm sáu ước enzyme riêng biệt, kết thúc với sản phẩm là protoporphyrin IX. Tất cả các ước sinh tổng hợp đến thời điểm này là như nhau cho sự tổng hợp của cả hai chất diệp lục và heme. hưng ở đây các nhánh con đường và hình thành các phân tử phụ thuộc vào kim loại được đưa vào trung tâm của porphyrin. Nếu magiê được chèn vào bởi một enzym gọi là magiê chelatase, nếu sắt được đưa vào cuối cùng trở thành heme. Giai đoạn tiếp theo của quá trình sinh tổng hợp chất diệp lục là sự hình thành của vòng thứ năm (vòng E), tạo vòng của một trong những chuỗi bên axit propionic để tạo protochlorophyllide. Con đường liên quan đến việc giảm một trong những liên kết đôi trong vòng D, sử dụng ADP . uá trình này được điều khiển bởi ánh sáng và được thực hiện bởi một enzyme gọi là protochlorophyllide oxidoreductase (POR). Giai đoạn cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp chất diệp lục là sự ràng buộc phytol, được xúc tác bởi en- zyme là synthetase để tạo chlorophyll [97], [130].
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy một số hợp chất hóa học trong chè
1.3.1. Ánh sáng
Ánh sáng có vai trò quan trọng đối với các cơ thể sống, là một trong những yếu tố quan trọng nhất của môi trường ảnh hưởng đến quá trình điều hòa sinh trưởng và phát triển của cây trồng [30], [49]. Cây chè là cây trung tính, kể từ lúc còn nhỏ và phát triển sau này nó hoàn toàn ưa sáng. Dưới óng râm, lá ch xanh đậm, lóng dài, búp non và mềm mại được duy trì trong thời gian dài, hàm lượng nước cao nhưng úp thưa. nh sáng tán xạ ở vùng núi cao có tác dụng tốt đến phẩm chất ch hơn ánh sáng trực xạ, lá chè có mầu xanh hơn so với lá của cây chè phát triển trong điều kiện thường và kết quả nồng độ axit amin tổng số cao [138]. Có sự khác biệt về nồng độ axit amin giữa ánh sáng mặt trời mạnh tự nhiên và có xử lý che bóng, nồng độ axit amin tổng số của lá chè phát triển trong ánh sáng mặt trời tự nhiên giảm 44,3%, so với lá ch được che chắn [117].
Theo tác giả Lan-Sook Lee và cộng sự đã nghiên cứu cây chè trong quá trình sinh trưởng và phát triển thường chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường không khí. Tác giả cho rằng khi phát triển tại cùng vị trí thì cây ch được che bóng sẽ cho chất lượng cao hơn, khi uống có vị thơm dịu hơn so với không che bóng [85] và có thể sử dụng làm nguyên liệu để chế biến matcha. Phân tích thành phần các chất trong dịch chiết từ lá chè theo thời gian che
29
phủ 0, 15, 18, 20 ngày, kết quả cho thấy theo thời gian che phủ các hợp chất như: quercetin - galactosylrutinoside, kaempferol - glucosylrutinoside, epicatechin gallate, tryptophan, phe- nylalanine, theanine, glutamine và caphein tăng, nhưng quercetin - glucosylrutinoside, kaempferol - glucoside, epigallocatechin gallate, gallocatechin và epigallocatechin lại có xu hướng giảm [47], [68], [81], [94]. hư vậy, việc che bóng mát cho cây ch đã làm thay đổi thành phần hóa học của lá ch , cũng có nghĩa là đã làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng và tính cảm quan của ch xanh. Trên cơ sở nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã đưa ra giả thuyết về con đường chuyển hóa các chất trong lá chè liên quan đến tác động của ánh sáng có cường độ yếu từ đó có thể làm sáng tỏ mối quan hệ giữa việc che nắng cho cây chè và chất lượng ch được thể hiện ở hình 1.18 [84]:
Caphein Theobromin Paraxathin 7-methyl xanthine Xanthosin Xanthin Glutamin Glutamat Theanine
30
Hình 1. 18. Sơ đồ chuyển hóa các chất cơ bản trong cây chè được che bóng
Nguồn [84] Chú thích:
Biểu thị hàm lượng tăng khi che nắng Biểu thị hàm lượng giảm khi che nắng
L - theanine là axit amin phong phú nhất trong lá chè và tiếp theo glutamate. Valine không được phát hiện trong mẫu ánh sáng mặt trời tự nhiên, alanine và cysteine không được phát hiện trong mẫu ánh sáng mặt trời được che chắn. Điều này cho thấy sinh tổng hợp và tích lũy của các axit amin trong cây chè bị ảnh hưởng bởi cường độ ánh sáng [117].
Tryptophan Chorismat Phenylalarin Naringenin Dihydrokaempferol Myrecetin Dihydroquercetin Dihydromyrecetin Kaempferol Kaempferol – glucosid Kaempferol glucosyIrutinosid Quercetin Quercetin galatosy Irutinosi Quercetin glucosy Irutinosi EC Catechin ECG CG Myrecetin/ glucosi/ galactosi GC EGC EGCG
31
Khi cây chè được tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, mức độ chiếu sáng cao thì mức độ biểu hiện của sắc tố quang hợp bao gồm chlorophyll, neoxanthin, violaxanthin, phytoxanthin và β-carotene giảm [139]. Trong trường hợp này, lục lạp phân giải một phần, cùng với màng thylakoid. Mầu sắc lá chè hoàn lại khi lá ch được bảo vệ khỏi ánh sáng trực tiếp mạnh mẽ của ánh sáng mặt trời. Đây được coi là sự phát triển bị chặn của lục lạp và sắc tố quang hợp trong lá chè ức chế sự sinh tổng hợp protein, dẫn đến sự tích tụ các axit amin tự do. Điều này giải thích tại sao cây ch được che óng thì hàm lượng axit amin tăng, đặc biệt là hàm lượng L - theanine [129].
L - theanine là một axit amin tự do có trong ch xanh và đặc biệt có nhiều trong matcha, L - theanine là chất có vai trò quan trọng nhất trong việc mang lại hương vị dịu ngọt (umani) của nước chè xanh. L - theanine được tổng hợp từ rễ, đưa lên lá ch và được chuyển thành các polyphenol do tác dụng của ánh sáng mặt trời. Vì lý do này, một số nơi người ta dùng lưới đen, làm giàn bằng rơm, rạ che phủ lên cây ch trước khi thu hoạch để giảm bớt cường độ chiếu sáng trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Nhiều thực nghiệm của các nhà khoa học Nhật Bản đã cho thấy khi cường độ chiếu sáng của mặt trời lên cây chè giảm thì làm tăng hàm lượng L - theanine và chlorophyll, tuy nhiên sự giảm cường độ chiếu sáng lên cây chè cũng chỉ ở một mức độ nào đó, nếu giảm quá nhiều đến mức gần như không còn ánh sáng chiếu lên cây chè nữa thì hàm lượng của L - theanine và chlorophyll lại giảm. Theo tác giả Nguyễn Đặng Dung, Lê hư Bích khi dùng tấm vải để che phủ lên cây chè với mức che phủ giảm cường độ chiếu sáng tới 90% trong 5 ngày và 15 ngày cuối trước khi thu hoạch của 2 giống chè Yabukita, Sayamakaori trồng tại vùng ew South Wales (Úc) đã làm tăng đáng kể hàm lượng L - theanine tới 18,95 mg/g chất khô và 21,16 mg/g chất khô so với 14,86 mg/g chất khô của mẫu chè chỉ được che phủ giảm cường độ chiếu sáng 50% trong toàn bộ thời gian sinh trưởng, còn hàm lượng caphein tăng không đáng kể, đặc biệt hàm lượng EGCG lại giảm đi theo mức độ che phủ [2]. Điều này có nghĩa khi cường độ ánh sáng chiếu lên cây chè giảm càng nhiều thì hàm lượng L - theanine càng tăng và hàm lượng EGCG càng giảm. Tùy theo cường độ và chất lượng của ánh sáng mà nó ảnh hưởng nhiều hay ít đến quá trình trao đổi chất và năng lượng cùng nhiều quá trình sinh lý của các cơ thể sống [142].
Tác giả O. Kuntze đã nghiên cứu cho rằng, phương pháp canh tác khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng ch do thay đổi quá trình tổng hợp các chất flavonoid. Phương pháp che