- Một số kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn đối kháng
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu bệnh thối nõn cây mạch môn tại Phú Thọ
Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh được tiến hành theo phương pháp Koch [92], cụ thể theo 4 bước:
* Mô tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết.
* Phân lập tác nhân gây bệnh và thông qua đó mô tả và giám định.
* Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây khoẻ, quan sát triệu chứng bệnh biểu hiện có giống như mô tả ban đầu không.
* Phân lập lại tác nhân gây bệnh được lấy từ nguồn đã lây nhiễm để xác định giống như nguồn bệnh ban đầu.
2.3.3.1 Phương pháp phân lập bệnh thối nõn trên cây mạch môn
Mẫu bệnh thu thập trên đồng ruộng tại huyện Hạ Hòa, tỉnh Phú Thọ, được phân lập theo phương pháp thường quy của Viện Bảo vệ thực vật, đặt trên môi trường nghèo dinh dưỡng PCA [59].
* Phương pháp phân lập ký sinh gây bệnh trực tiếp từ mẫu cây bệnh
- Rửa mẫu bệnh dưới vòi nước. - Lựa chọn các mô bệnh điển hình.
- Cắt mô bệnh thành những miếng có kích thước 1x1cm. Miếng cắt phải có cả mô bệnh và mô khoẻ. Khử trùng bề mặt bằng cồn 700
trong 15 - 20 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
- Thấm khô miếng cắt bằng giấy thấm vô trùng, dùng dao đã khử trùng cắt vết bệnh thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm.
47
- Đặt các mảnh mô cây vào môi trường nghèo dinh dưỡng (WA, CA). - Khi nấm đã phát triển với kích thước 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường thích hợp như: PDA, CMA.
* Phương pháp phân lập nấm Pythium sp. bằng sử dụng mồi bẫy
Phương pháp phân lập Pythium sp. từ mô bệnh cây mạch môn bằng sử dụng mồi bẫy: cánh hoa và quả (Một số loại quả như: đu đủ, táo, lê, …thường phải xanh), theo Erwin, D.C. and Riberrio O.K (1996) [106].
- Lấy mẫu nõn lá của cây bị bệnh.
- Cho đất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc. Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để đất lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm).
- Cắt cánh hoa có màu sắc 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên.
- Để cốc bẫy bào tử qua đêm ở nhiệt độ 20 - 250C.
- Quan sát cánh hoa sau: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày. Khi thấy cánh hoa bị mất màu đem lên kính hiển vi soi, quan sát thấy bào tử nấm Pythium sp.
- Đem cánh hoa cấy lên môi trường: PCA, CMA, CA...
2.3.3.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo xác định tác nhân gây bệnh
* Lây bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm:
- Hộp petri có để giấy giữ ẩm, thu phần lá nõn của cây mạch môn đặt lên trên giấy. Cắt mẩu thạch chứa nấm Pythium sp., Fusarium sp. đặt lên phần nõn của cây mạch môn 1 tuổi
- Mỗi công thức làm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 hộp petri. * Lây bệnh trong điều kiện nhà lưới:
- Cây mạch môn 1 tuổi được trồng trong chậu.
- Điều kiện lây bệnh: được phun sương giữ ẩm 12h/ ngày bằng máy phun sương có đặt giờ ngắt tự động, nhiệt độ: 300
C. Điều kiện khống chế để lây nhiễm là điều kiện ẩm ướt.
48
- Phương pháp lây bệnh qua đất với nấm Pythium sp., Fusarium sp. cho cây mạch môn theo phương pháp của tác giả Drenth và Sendall (2004 [91]: Nhân nuôi nguồn nấm trên giá thể là hạt kê đã được hấp khử trùng trong bình tam giác.
+ Lấy hạt kê đem rửa sạch, cho vào bình tam giác (1/3 – 2/5 bình). + Cắt 10 miếng thạch có chứa nguồn nấm với kích thước mỗi miếng: 1,5 cm x 1,5 cm cho vào trong bình.
+ Nấm nhân nuôi trên môi trường hạt kê trong vòng 10 – 15 ngày, lấy ra trộn vào trong đất về bốn phía của cây.
2.3.3.3. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh thối nõn cây mạch môn bằng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử
- Chuẩn bị nguồn nấm:
Mẫu nấm Pythium sp. được phân lập từ mẫu bệnh thối nõn cây mạch môn thu thập tại tỉnh Phú Thọ (tuổi cây khi thu thập từ 6 tháng đến 1 năm). Sau khi được phân lập từ cây bệnh, nấm được nuôi cấy trên môi trường V8 agar ở 280
C. Tiếp theo, nấm được chuyển sang nuôi cấy ở môi trường V8 lỏng (10%) ở nhiệt độ 250
C trong 3-7 ngày trong điều kiện lắc (100 rpm).
- Tách chiết DNA:
DNA được chiết theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) [98]. Nấm được nuôi cấy trên môi trường V8 lỏng 10% trong 3 ngày. Khoảng 100 mg sợi nấm được chuyển sang ống effpendorf 1,5 ml và được rửa với 1 ml nước cất. Nấm được nghiền trong ống effpendorf với 500 µl đệm chiết (2M NaCl, 25 mM EDTA, 100 mM Tris -HCl, 2% PVP và 2% CTAB) dùng chày nhựa nhỏ. Dịch nghiền được chiết 2 lần với chlorophorm: isoamyl alcohol (24:1). Kết tủa DNA được rửa 2 lần bằng ethanol 70 %, làm khô trong không khí 30 phút và được hòa trong 50 µl đệm TE. Dịch DNA được giữ ở -200
C.
49
DNA được chiết từ các mẫu nấm nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide ) của Doyle & Doyle (1987) [98]. DNA được hòa trong 50 µL đệm TE và bảo quản ở -200C.
Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm.
Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 500
C.
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 2 chiều dùng mồi PCR và kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR (Hãng Macrogen). Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
- Phân tích trình tự:
Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information)
Phân tích trình tự được thực hiện dùng các phầm mềm ClustalX và MEGA5.1.
2.3.3.4 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái của tác nhân gây bệnh thối nõn cây mạch môn
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm bệnh: Các ngưỡng nhiệt độ cần theo dõi: 15o
C, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Phương pháp tiến hành các thí nghiệm trên: Nấm được nuôi cấy trên hộp petri, sau đó đặt trong tủ định ôn có điều khiển được các ngưỡng nhiệt độ như đã nêu trên. Mỗi công thức thí nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 hộp petri.
50
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến sinh trưởng của nấm bệnh: Thí nghiệm bao gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối liên tục. Phương pháp tiến hành các thí nghiệm trên: nấm được nuôi cấy trên hộp petri, sau đó đặt ở các mức ánh sáng nêu trên. Mỗi công thức thí nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 hộp petri.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH khác nhau đến sinh trưởng của nấm bệnh: Các ngưỡng pH làm thí nghiệm là: 5,0 - 5,5 - 6,0 - 6,5 - 7,0 - 7,5 - 8,0 (Các ngưỡng pH chọn thí nghiệm tương ứng với ngưỡng pH có thể của đất trồng). Phương pháp tiến hành các thí nghiệm trên: Nấm được nuôi cấy trên hộp petri, sau đó sử dụng dung dịch axit HCl và NaOH để chỉnh pH. Sử dụng máy đo pH để chuẩn các mức nêu trên.
Mỗi công thức thí nghiệm thực hiện 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 hộp petri; Chỉ tiêu theo dõi của các thí nghiệm: theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngày thứ 1, 2, 3 sau khi cấy bằng cách đo đường kính tản nấm.
2.3.3.5. Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh thối nõn cây mạch môn * Phương pháp xác định hiệu quả phòng trừ của biện pháp sinh học với nấm bệnh trong phòng thí nghiệm:
- Nghiên cứu khả năng ức chế của nấm đối kháng Trichoderma asperellum với nấm P. helicoides (thí nghiệm trong điều kiện Invitro):
+ Môi trường thí nghiệm: PDA
Nấm Trichoderma asperellum và nấm P. helicoides được nuôi cấy trên hộp petri, sử dụng đục lỗ trên mặt thạch của hộp petri đã mọc nấm. Đặt miếng thạch chứa nấm bằng phương pháp cấy đối xứng
+ Chỉ tiêu theo dõi: đường kính ức chế của tản nấm
- Hiệu quả ức chế của vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng với nấm P. helicoides (thí nghiệm trong điều kiện Invitro):
+ Nguồn vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và xạ khuẩn Streptomyces misionensis, Streptomyces aureofaciens trong thí nghiệm được Viện bảo vệ
51
thực vật cung cấp. Đánh giá khả năng đối kháng của các vi khuẩn và xạ khuẩn bằng chất kháng sinh ức chế nấm P. helicoides gây bệnh thối nõn cây mạch môn được tiến hành cấy theo phương pháp đối xứng, vi khuẩn hoặc xạ khuẩn được cấy đối xứng về 4 phía, nấm Pythium sp. được đặt ở trung tâm, đo đường kính tản nấm sau cấy (Viện Bảo vệ thực vật, 2000) [59]
+ Mỗi công thức làm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc 3 hộp petri.
* Nghiên cứu hiệu lực của một số loại thuốc hoá học với nấm bệnh: + Thí nghiệm với 5 công thức: (i) Ridomil 72 MZ 0,2%; (ii) Viben - C 50 BTN 0,2%; (iii) Aliette 80WP 0,1%; (iv) Copper - Zinc 85 WP 0,2%; (v) Công thức đối chứng: không xử lý (phun nước lã).
+ Phương pháp tiến hành: Môi trường PDA được hấp khử trùng để nguội 450C hoà thuốc vào trong môi trường rồi đổ ra hộp petri, mỗi công thức 3 lần nhắc, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri. Sợi nấm Pythium sp. được cấy thuần, sử dụng phương pháp đục lỗ trên mặt thạch, cấy lên các hộp petri. Theo dõi sự phát triển của sợi nấm sau cấy: 1, 2, 3 ngày (Viện Bảo vệ thực vật, 1999) [60]. Tính hiệu quả phòng trừ theo phương pháp của Abbott.
* Nghiên cứu hiệu lực của thuốc trên đồng ruộng
+ Thí nghiệm với 6 công thức: (i) Phun Aliette 80 WP nồng độ 0,2%; (ii) Phun Ridomil gold 68 WG nồng độ 0,3%; (iii) Phun chế phẩm
Trichoderma asperellum; (iv) Phun chế phẩm Streptomyces aureofaciens; (v) Phun chế phẩm Bacillus amyloliquefaciens; (vi) Công thức đối chứng: không xử lý (phun nước lã).
+ Phương pháp tiến hành: Thí nghiệm diện hẹp, bố trí theo khối ngẫu nhiên, mỗi ô 50 m2, 3 lần nhắc lại (Viện Bảo vệ thực vật, 1999) [60]
+ Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ bệnh (%) trước xử lý và sau xử lý 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 6 tháng. Tính hiệu quả phòng trừ theo phương pháp của Henderson-Tilton.
52