, Nguyễn Thị Phương Thảo1 Nguyễn Thanh Hải1 Nguyễn Thị Lâm Hải1 Ninh Thị Thảo1 Nguyễn Thị Châm
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu thí nghiệm
2.1. Vật liệu thí nghiệm
Vật liệu phân lập nấm mốc: các chủng nấm mốc được phân lập từ các nguồn vật liệu khác nhau: mẫu lá mục, lạc, gạo, tổ ong mốc, vỏ chanh được lấy từ các khu vực và địa điểm khác nhau: Hà Nội, Nam Định.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các chủng nấm mốc Aspergillus được phân lập theo phương pháp Ulster (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000) trên loại môi trường phân lập là PDA và Czapek-Dox. Sau đó làm thuần bằng cách cấy truyền trên môi trường PDA. Các chủng nấm mốc Aspergillus được nuôi lắc trong môi trường Czapek-Dox lỏng pH 5.5 (Sigma- Mỹ), tốc độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 35oC, mật độ tiếp giống 106 bào tử cho 100ml môi trường lên men. Sau 3 ngày nuôi cấy thu dịch nuôi đem li tâm 10000 rpm ở 4oC trong 20 phút. Phần dịch lỏng thu được sau li tâm sẽ được đưa đi thử hoạt tính enzyme invertase. Dựa vào nguyên lý enzyme invertase có khả năng thủy phân liên kết β-1,2 glucoside của sucrose sản phẩm là glucose và fructose tỉ lệ 1:1. Hoạt tính tương đối của enzyme invertase được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch: phương pháp này sử dụng thuốc thử TTC 0.1% (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride trong NaOH 0,5M). Đường khử (glucose) sinh ra từ quá trình thủy phân sucrose của enzyme invertase sẽ khử TTC thành triphenyformazon có màu hồng, lượng triphenyformazon tỉ lệ thuận với lượng đường khử sinh ra. Giếng thạch được đục trong môi trường cơ chất sucrose 3% trong đệm natri acetate 50mM pH 5,0. Cho 100µl dịch enzyme thô vào vào giếng để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thuốc thử TTC được thêm vào bằng cách phun lên mặt thạch và ủ trong bóng tối 20 phút, rửa đệm acetate 0,1M pH 5,0. Enzyme invertase khuếch tán vào đĩa thạch sản phẩm thủy phân của nó được khẳng định bằng sự xuất hiện vòng đỏ quanh giếng.
Phương pháp so màu DNS: Ủ hỗn hợp phản ứng gồm 200µl enzyme thô, 500µl dung dịch sucrose 5% và 300µl đệm acetate 50mM pH 5,0 ở 500C trong 30 phút (Bernfeld et al.,1955). 1ml DNS (3, 5-dinitrosalicylic acid) được cho thêm vào hỗn hợp trên và kết thúc phản ứng bằng cách ngâm ống nghiệm trong bể nước sôi 5 phút. Sau khi làm lạnh bằng nước tới nhiệt độ phòng dung dịch phản ứng được dùng để xác định lượng đường khử glucose sinh ra bằng cách đo OD540.