, Trần Thị Hiền1 Nguyễn Thị Thu Phương 1 Nguyễn Thị Xuyến
2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Vật liệu
2.1. Vật liệu
Mẫu tôm nghi ngờ nhiễm với MBV được chuyển giao từ đề tài nghiên cứu của Huynh Dang Sang và ctv (2013). Dòng vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp được chuyển giao từ đề tài nghiên cứu của Bùi Cách Tuyến và ctv (2014)
2.2. Phương pháp
2.2.1. Ly trích DNA và thực hiện PCR
Mẫu tôm được ly trích DNA theo hướng dẫn của hãng Biobasic. DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vi-rút theo nghiên cứu của Huynh Dang Sang và ctv (2013).
2.2.2. Tạo và biến nạp vec-tơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5α
Sản phẩm khuếch đại dương tính với MBV được chèn vào vec-tơ pGEM – T theo quy trình hướng dẫn của hãng Promega. Vec-tơ tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào chủE.coliDH5α dựa trên nghiên cứu của Bùi Cách Tuyến và ctv (2014). Sau khi biến nạp, dịch huyền phù vi khuẩn được hành cấy trang trên đĩa môi trường LB thạch có Ampicillin/X- gal/IPTG và ủ ở 370C từ 14 – 16 tiếng.
2.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp
Dịch huyền phù của các khuẩn lạc màu trắng đã được kiểm tra với cặp mồi l261F/261R bằng PCR. Bên cạnh đó, cặp mồi SP6 (trình tự 5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’) và M13 (trình tự 5’ TATTTAGGTGACACTATAG 3’) có vị trí bắt cặp nằm trên plasmid cũng đã được sử dụng để chạy PCR với dịch huyền phù nhằm khẳng định chính xác sự hiện diện của véc-tơ tái tổ hợp trong các dòng vi khuẩn E.coli DH5α màu trắng. Mỗi phản ứng PCR chứa 25 µl với các thành phần phản ứng sau: Master Mix (hãng Bioline), 0,3 µM cho mỗi mồi. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gồm 940C trong 5 phút, 35 chu kì ở 94oC 1 phút, 50oC 1 phút, 72oC 1 phút và kết thúc ở 72oC trong 5 phút.Hơn thế nữa, sản phẩm khuếch đại với cặp Sp6 và M13 còn được giải trình tự và so sánh độ tương đồng với các trình tự MBV đã công bố bằng công cụ Blast trên cơ sở dữ liệu NCBI.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả sàng lọc sản phẩm khuếch đại dương tính
Kết quả thực hiện PCR và điện di cho thấy trong số 4 mẫu tôm có triệu chứng chậm lớn được cung cấp với Huynh Dang Sang và ctv (2013) chỉ có 2 mẫu xuất hiện băng đích 261 bp (giếng số 1 và 3) và 2 mẫu không có băng (giếng số 2 và 4). Như vậy mẫu tôm ở giếng số 1 và số 3 đã nhiễm MBV trong khi đó mẫu tôm ở giếng số 2 và 4 mặc dù có đặc điểm chậm lớn nhưng không phải do nhiễm MBV. Kết quả kiểm tra này phù hợp với nghiên cứu của Win và ctv (2005) khi tác giả phát triển quy trình phát hiện chính xác MBV với cặp mồi 261F/261R. Sản phẩm PCR dương tính với MBV tiếp tục được sử dụng để tạo vec-tơ tái tổ hợp với plasmid pGEM-Teasy.
429
Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 261F/261R
Giếng 1 đến 4: các mẫu tôm, 5: mẫu âm, 6: thang DNA 100 bp
3.2. Kết quả tạo dòng plasmid tái tổ hợp
Sau khi tạo và biến nạp vec-tơ tái tổ hợp vào tế bào chủ E.coli DH5α, dịch vi khuẩn được cấy trang trên môi trường thạch LB có chứa Ampicillin/X-gal/IPTG. Đĩa khuẩn lạc nuôi cấy xuất hiện đồng thời cả khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh. Khuẩn lạc trắng nghi ngờ có mang véc-tơ tái tổ hợp chứa trình tự đích trong khi đó khuẩn lạc xanh chỉ mang đơn thuần mang plasmid pGEM-Teasy.
Hình 2. Đĩa khuẩn lạc trắng xanh trên môi trường thạch LB có chứa Ampicillin/X-gal/IPTG
Từ đĩa nuôi cấy, 8 dòng khuẩn lạc màu trắng nghi ngờ có mang véc-tơ tái tổ hợp đã được chọn để kiểm tra bằng PCR với cặp mồi 261R và 261F. Kết quả điện di thể hiện trong 9 dòng khuẩn lạc trắng được chọn chỉ có duy nhất 1 dòng có khả năng mang trình tự MBV khi xuất hiện băng đích 261 bp (giếng số 8, hình 3). 8 dòng khuẩn lạc còn lại mặc dù có chứa véc- tơ tái tổ hợp nhưng không chứa trình tự MBV. Nguyên nhân có thể là sự tạp nhiễm các dòng vi khuẩn có mang véc-tơ tái tổ hợp từ môi trường xung quanh. Như vậy, kết quả sàng lọc trắng xanh thu nhận được 1 dòng duy nhất khuẩn lạc E.coli DH5α mang có khả năng mang trình tự MBV. Dòng khuẩn lạc này được tăng sinh trong môi trường LB có bổ sung kháng
430
sinh, sau đó được ly trích plasmid và tiếp tục khẳng định lại bằng phản ứng PCR với mồi 261F/261R và SP6/M13.
Hình 3. Kết quả kiểm tra các dòng khuẩn lạc trắng với cặp mồi 261F và 261R
Giếng 1: thang DNA, giếng 2 đến 9: các dòng khuẩn lạc trắng
Khả năng thu nhận thành công plasmid mang trình tự của MBV là rất công khi khẳng định lại bằng phương pháp PCR với mồi 261F/261R và SP6/M13. Dòng plasmid đã hình thành sản phẩm khuếch đại 261 bp khi thực hiện với cặp mồi 261F/261R (giếng 1, hình 4). Kết quả này hoàn toàn tương ứng với các nghiên cứu của Win và ctv (2005), Huỳnh Đăng Sang và ctv (2013), cặp mồi 261F/261R là cặp mồi chuyên biệt với MBV và sẽ hình thành sản phẩm khuếch đại 261 bp nếu như DNA khuôn có trình tự của MBV. Như vậy, plasmid ly trích có trình tự của MBV. Hơn thế nữa, cặp mồi SP6/M13 cũng đã được sử dụng để kiểm tra plasmid. Kết quả điện di cho thấy kết quả khuếch đại có kích thước khoảng 458 bp (giếng 2, hình 4). Theo Huỳnh Thanh Trúc (2014), cặp mồi SP6/M13 có vị trí bắt cặp nằm trên plasmid pGEM-Teasy và khoảng cách từ vị trí bắt cặp của SP6 đến vị trí bắt cặp của M13 là 197 bp. Vùng trình tự được khuếch đại bởi cặp mồi SP6/M13 còn chứa vị trí chèn của trình tự đích nên kích thước của sẽ phẩm khuếch đại sẽ bao gồm 1 phần trình tự của plasmid và trình tự đích chèn vào plasmid. Như vậy, với kích thước sản phẩm khuếch đại 458 bp, nghiên cứu này lại một lần nữa khẳng định plasmid thu được chắc chắn có mang vùng trình tự 261 bp của MBV.
Hình 4. Kết quả điện di sau khi kiểm tra plasmid với cặp mồi 261F/261R và SP6/M13
Giếng 1: ladder 1kb, 2: sản phẩm PCR với cặp mồi 261F/261R, 3: sản phẩm PCR với cặp mồi SP6/M13.
431
Phương pháp giải trình tự đã được sử dụng để khẳng định lần cuối plasmid thu được có mang chính xác trình tự của MBV. Sản phẩm khuếch đại của plasmid với cặp mồi SP6/M13 đã được giải trình tự mạch xuôi và mạch ngược. Sau khi tiến hành so sánh độ tương đồng của trình tự khuếch đại với các trình tự đã công bố bằng công cụ BLAST, sản phẩm khuếch đại có độ tương đồng rất cao (99%) với trình tự MBV với mã số truy cập KJ184318.1 (Hình 5) . Như vậy, nghiên cứu này đã thu nhận thành công dòng plasmid có mang trình tự của MBV. Kết quả đo OD dòng plasmid này có nồng độ 40 ng/μl và tương ứng với 1,13x1010 bản sao/µl. Plasmid này sẽ được sử dụng làm đối chứng dương trong quy trình phát hiện MBV. Hơn thế nữa, dòng vi khuẩn E.coli DH5α có mang véc-tơ tái tổ hợp cũng đã được thu nhận và trữ ở tủ đông -70o
C
Hình 5. So sánh độ tương đồng của trình tự khuếch đại bằng cặp mồi SP6/M13 với trình tự MBV có mã số KJ184318.1
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});