Các bước rửa được tiến hành như sau: nhẹ nhàng hút bỏ PEG, bổ sung 200 µl dung dịch rửa Ca2+ (11% Sucrose, 0,38% Glycinevà 0,74% CaCl2) vào mỗi giọt tế bào trần dung hợp. Sau 20 phút, dùng micropipet từ từ loại bỏ dung dịch Ca2+ và PEG cịn lại.
- Rửa lại hỗn hợp tế bào bằng mơi trường nuơi rồi bổ sung 2ml mơi trường nuơi. trường nuơi.
2.2.4.Phương pháp nuơi cấy sau dung hợp
1. Sau khi dung hợp, hút dịch protoplast vào đĩa petri (Ø = 3,5cm) + 1,8 ml mơi trường nuơi (VKM II ); quấn chặt parafilm và nuơi trong điều kiện 250C mơi trường nuơi (VKM II ); quấn chặt parafilm và nuơi trong điều kiện 250C và tối.
2. Các tế bào sẽ bắt đầu phân chia sau 2-3 ngày sau khi dung hợp (quan sát trên kính hiển vi). trên kính hiển vi).
3. Sự kết tụ tế bào (sự tạo thành microcalli) được hình thành sau 3-4 tuần nuơi cấy; chuyển các calli sang mơi trường rắn (Cul-medium- Haberlach et nuơi cấy; chuyển các calli sang mơi trường rắn (Cul-medium- Haberlach et al., 1985 ) trên đĩa petri (Ø = 11 cm), đặt trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, cường độ ánh sáng 4000 lux và nhiệt độ 22 0C.
4. Sau 4 tuần, chuyển các callus vào mơi trường tái sinh (RJM- Mollers và Wenzel.,1992). Các callus này sẽ hình thành các chồi đầu tiên sau 8-12 tùy Wenzel.,1992). Các callus này sẽ hình thành các chồi đầu tiên sau 8-12 tùy thuộc vào từng kiểu gen.
7
5. Chuyển các chồi này vào trong ống nghiệm chứa mơi trường MS để phục vụ cho các thí nghiệm phân tích và đánh giá tiếp theo. vụ cho các thí nghiệm phân tích và đánh giá tiếp theo.
2.3. Nội dung thí nghiệm:
Quá trình nghiên cứu được tiến hành qua các thí nghiệm sau:
2.3.1. Thí nghiệm 1: So sánh các nồng độ dung dịch PEG sử dụng đểdung hợp protoplast. dung hợp protoplast.
CT1: PEG 22,5% CT2: PEG 25% CT2: PEG 25% CT3: PEG 30% CT4: PEG 40%
2.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định thời gian ủ thích hợp với dung dịch PEG.
CT1: 1 Phút CT2: 2 Phút CT2: 2 Phút CT3: 3 Phút CT4: 4 Phút CT5: 5 Phút
2.3.3. Thí nghiệm 3: Xác định số lần rửa PEG thích hợp bằng dung dịch Ca2+ và bằng mơi trường nuơi. Ca2+ và bằng mơi trường nuơi.
CT1: 1 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 1 lần bằng mơi trường nuơi CT2: 1 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 2 lần bằng mơi trường nuơi CT2: 1 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 2 lần bằng mơi trường nuơi CT3: 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 1 lần bằng mơi trường nuơi CT4: 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 2 lần bằng mơi trường nuơi
2.3.4. Thí nghiệm 4: Xác định mật độ protoplast thích hợp để dung hợp các dịng nhị bội các dịng nhị bội
8
CT1: 2,00 x 106 tế bào/1ml CT2: 2,50 x 106 tế bào/1ml CT2: 2,50 x 106 tế bào/1ml CT3: 2,75 x 106 tế bào/1ml CT4: 3,00 x 106 tế bào/1ml.
2.3.5. Thí nghiệm 5: Xác định mơi trường thích hợp để nuơi cấy tế bào sau dung hợp PEG. sau dung hợp PEG.
Tiến hành thí nghiệm mơi trường nuơi cấy tế bào trần sau dung hợp của các dịng khoai tây trên các mơi trường VKM II (Thieme et al., 1997) , của các dịng khoai tây trên các mơi trường VKM II (Thieme et al., 1997) , Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006)
PHẦN III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả
Qua thí nghiệm tiến hành dung hợp protoplast trên đĩa petri nhựa và
đĩa petri thuỷ tinh cho thấy: các protoplast trên đĩa petri thuỷ tinh khơng cĩ sự kết lắng cần thiết cho dung hợp như với đĩa petri nhựa, sau khi hút bỏ sự kết lắng cần thiết cho dung hợp như với đĩa petri nhựa, sau khi hút bỏ
PEG thường sẽ hút theo protoplast cho nên hiệu quả dung hợp khơng cao. Vì thế việc sử dụng đĩa petri nhựa cho dung hợp là tốt nhất. Vì thế việc sử dụng đĩa petri nhựa cho dung hợp là tốt nhất.
3.1.1. Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ dung dịch PEG thích hợp cho dung hợp protoplast. dung hợp protoplast.
Chúng tơi tiến hành dung hợp ở các nồng độ PEG khác nhau (22,5%, 25%, 30%, 40%) kết quả cho thấy: với nồng độ 30%, 40% thì các tế bào 25%, 30%, 40%) kết quả cho thấy: với nồng độ 30%, 40% thì các tế bào dính thành cụm dày, bị vỡ nhiều và khĩ rửa sạch PEG. Nồng độ 22,5% cho mật độ hai tế bào dính vào nhau cao nhất, trong khi đĩ ở nồng độ 25% các tế
bào dính thành cụm 3-5 tế bào. Như vậy, cĩ thể khẳng định nồng độ PEG 22,5 % là thích hợp nhất cho dung hợp hai dịng nhị bội. 22,5 % là thích hợp nhất cho dung hợp hai dịng nhị bội.
9
Hình 3.1 Hình ảnh protoplast sau sau khi ủ PEG ở các nồng độ khác
nhau
Nhìn vào hình ảnh thu được sau quá trình dung hợp, ta cĩ thể nhận thấy sự ảnh hưởng rõ rệt của các nồng độ PEG khác nhau tới chất lượng của thấy sự ảnh hưởng rõ rệt của các nồng độ PEG khác nhau tới chất lượng của protoplast sau dung hợp.
- Ở PEG 40% thì PEG khĩ rửa sạch và các protoplast sau dung hợp kết dính chặt với nhau thành mảnh lớn. Sự kết tụ thành đám protoplast lớn này làm