cấy các tổ hợp lai của các dịng khoai tây nhị bội sau dung hợp tế bào trần phục vụ cơng tác tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng kỹ thuật này.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
Xây dựng được quy trình dung hợp bằng hố chất PEG cho các dịng nhị bội nghiên cứu bao gồm: dịng nhị bội nghiên cứu bao gồm:
- Xác định nồng độ PEG thích hợp để dung hợp - Xác định thời gian ủ PEG thích hợp - Xác định thời gian ủ PEG thích hợp
- Xác định được phương pháp rửa PEG thích hợp - Xác định mật độ protoplast thích hợpcho dung hợp - Xác định mật độ protoplast thích hợpcho dung hợp
- Xác định được mơi trường nuơi cấy thích hợp cho các tổ hợp lai sau dung hợp. dung hợp.
PHẦN II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu2.1.1. Vật liệu nghiên cứu. 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.
Vật liệu nghiên cứu gồm 8 dịng khoai tây nhị bội do Viện nghiên cứu nguồn gen cây trồng Cộng hịa liên bang Đức cung cấp là các dịng A15, nguồn gen cây trồng Cộng hịa liên bang Đức cung cấp là các dịng A15, A56, B186, A16, A41, H1959/195, H1929/34 và B208 và một dịng khoai nhị bội lấy từĐà Lạt (123.20).
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tạo vật liệu in vitro. 2.2.1. Tạo vật liệu in vitro.
Các dịng khoai tây nhị bội được đưa vào nuơi cấy in vitro để tạo nguyên liệu tách tế bào trần. Mơi trường nuơi cấy là mơi trường MS (phụ lục nguyên liệu tách tế bào trần. Mơi trường nuơi cấy là mơi trường MS (phụ lục
4
1) cĩ bổ sung thêm chất kháng etylen để tăng chỉ số diện tích lá phù hợp cho quá trình tách protoplast + 25g/l đường saccarose + 6,5g/l agar, pH: 5,7. quá trình tách protoplast + 25g/l đường saccarose + 6,5g/l agar, pH: 5,7. Cây in vitro được đặt trong phịng nuơi theo chế độ nhiệt độ là 220C, cường độ chiếu sáng là 3000-4000 lux, quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày.
2.2.2. Tách tế bào trần
Các lá non của khoai tây nhị bội in vitro 3-4 tuần tuổi được sử dụng làm nguyên liệu tách tế bào trần. Quy trình tách tế bào trần tiến hành theo làm nguyên liệu tách tế bào trần. Quy trình tách tế bào trần tiến hành theo Mollers (1990) cĩ cải tiến và sử dụng thêm các mơi trường khác, cụ thể gồm các bước như sau:
tách tế bào trần của các dịng khoai tây nhị bội nghiên cứu
1. Cắt nhỏ 1g lá khoai tây từ cây in vitro cĩ độ tuổi phù hợp tùy từng giống (cây của các dịng H1959/195, A56, A15, B186 3 tuần tuổi, cây của các (cây của các dịng H1959/195, A56, A15, B186 3 tuần tuổi, cây của các dịng A41, A56, B186, H1929/34: 4 tuần tuổi) trong đĩa petri vơ trùng (Φ
9cm) với 10ml dung dịch gây co nguyên sinh (Washing solution II gồm 0,5M Mannitol; 0,01% CaCl2; 0,06% MES), ủ 15-20 phút. 0,5M Mannitol; 0,01% CaCl2; 0,06% MES), ủ 15-20 phút.
2. Loại bỏ dịch co nguyên sinh, ủ đĩa lá với 10ml dung dịch enzyme cĩ nồng
độ Macerozym và Cellulose phù hợp tùy từng dịng trong 12-16h. Thành phần dung dịch enzyme gồm đa lượng, vi lượng và vitamin theo Murashige phần dung dịch enzyme gồm đa lượng, vi lượng và vitamin theo Murashige và Skoog (1962), riêng nồng độ NH4NO3 là 150mg/l; 11% Sucrose; 1% Polivynylpyrrolidon; 0,1% Bovine Serum Albumin; Macerozym; Cellulose (E1: 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulose; E2: 0,1% Macerozym, 0,6% Cellulase; E 3: 0,1% Macerozym, 0,8% Cellulase; E 4: 0,1% Macerozym, 1% Cellulase).
Các thơng số thích hợp cho tách tế bào trần của các dịng khoai tây nhị bội nghiên cứu. nhị bội nghiên cứu.
5 Dịng cây Tuổi cây cho mẫu lá (tuần) Dung dịch enzyme tách tế bào trần Thời gian ủ mẫu lá với
dung dịch enzyme (giờ)
H1959/195 3 2 16 A15 3 1 15 A16 3 1 15 A41 4 2 15 A56 4 3 15 B186 3 1 14 B208 4 1 14 H1929/34 4 4 14
4. Thu tế bào trần: Lắc nhẹ dịch ủ giữa lá và enzyme trong 5-10 phút. Lọc loại bỏ màng lá qua hệ thống rây lọc 2 lớp 100µm và 50µm. Tráng rây lọc loại bỏ màng lá qua hệ thống rây lọc 2 lớp 100µm và 50µm. Tráng rây lọc với 5ml dung dịch nổi (Rinse solution). Ly tâm lần 1 trong 15 phút với tốc
độ 600 vịng/phút. Thu tế bào trần (dịch màu xanh đậm trên bề mặt ống ly tâm). Thành phần rise solution gồm: MS- muối (NH4NO3 là 150mg/l), MS- tâm). Thành phần rise solution gồm: MS- muối (NH4NO3 là 150mg/l), MS- vitamin, 11% Sucrose.
5.Rửa tế bào trần: Bổ sung 5ml dung dịch rửa I (Washing solution I), ly tâm lần 2 ở 700 vịng/phút trong 5 phút. Sau ly tâm, loại bỏ dịch trong, bổ sung lần 2 ở 700 vịng/phút trong 5 phút. Sau ly tâm, loại bỏ dịch trong, bổ sung thêm 5ml dung dịch rửa I ly tâm 700 vịng/phút trong 5 phút. Sau ly tâm loại bỏ dịch trong. Washing solution I: MS- muối (NH4NO3là 150mg/l), MS- vitamin, 0,29M NaCl. Bổ sung 1ml mơi trường nuơi thích hợp để xác định mật độ tế bào trần bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi.
2.2.3. Dung hợp
Phương pháp dung hợp tế bào trần bằng PEG được tiến hành theo Kao và Michaylux (1974) và được cải tiến theo Menczel và cs (1981) bao Kao và Michaylux (1974) và được cải tiến theo Menczel và cs (1981) bao gồm bước sau:
- Trộn lẫn tế bào trần của hai dịng khoai tây nhị bội khác nhau cĩ mật
6
- Tiến hành dung hợp tế bào trần bằng hĩa chất PEG 8000 trên đĩa petri nhựa (φ 3,5cm): nhỏ 100 µl hỗn hợp tế bào trần vào đĩa dung hợp. Để nhựa (φ 3,5cm): nhỏ 100 µl hỗn hợp tế bào trần vào đĩa dung hợp. Để
lắng tế bào trong 15 phút ở nhiệt độ phịng, nhỏ 25 µl PEG vào hỗn hợp tế bào trần. Ủ hỗn hợp tế bào bằng PEG 3-4 phút. hợp tế bào trần. Ủ hỗn hợp tế bào bằng PEG 3-4 phút.