đám tế bào, các tế bào này dính chặt với nhau nên PEG khĩ rửa sạch và làm tế bào bị vỡ khi tiến hành rửa dung hợp. Đặc biệt ủ với thời gian 10 phút là tế bào bị vỡ khi tiến hành rửa dung hợp. Đặc biệt ủ với thời gian 10 phút là thời gian quá dài nên tế bào bị vỡ nát và dính thành từng đám khĩ tách rời như hình ảnh 3.2.
Do vậy bổ sung 25µl PEG 22,5%, thời gian ủ 3 phút là thích hợp nhất.
3.1.3. Thí nghiệm 3: Xác định số lần rửa PEG thích hợp bằng dung dịch Ca2+ và bằng mơi trường nuơi. Ca2+ và bằng mơi trường nuơi.
Việc rửa sạch PEG sau dung hợp là rất quan trọng vì nĩ ảnh hưởng
đến chất lượng các tế bào lai sau dung hợp cũng như khả năng phân chia tạo microcallus của chúng. Do đĩ chúng tơi tiến hành các phương pháp rửa khác microcallus của chúng. Do đĩ chúng tơi tiến hành các phương pháp rửa khác nhau: 1 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 1 lần bằng mơi trường nuơi; 1 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 2 lần bằng mơi trường nuơi; 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 1 lần bằng mơi trường nuơi; 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 2 lần bằng mơi trường nuơi. Kết quả cho thấy phương pháp rửa 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2+ và 1 lần bằng mơi trường nuơi là thích hợp nhất, các protoplast sau dung hợp ít bị vỡ và khả năng phân chia sau đĩ tốt hơn.
12
Rửa sạch PEG Khơng rửa sạch PEG
Hình 3.3 Hình ảnh phân chia của các protoplast sau dung hợp 4 ngày
3.3.4. Thí nghiệm 4: Xác định mật độ protoplast thích hợp để dung hợp các dịng nhị bội các dịng nhị bội
Đối với phương pháp dung hợp bằng hố chất PEG, để xác suất tạo ra sự kết dính đơi giữa 2 protoplast của 2 dịng nhị bội khác nhau (yếu tố mong sự kết dính đơi giữa 2 protoplast của 2 dịng nhị bội khác nhau (yếu tố mong muốn cĩ được tạo điều kiện cho dung hợp xảy ra trong quá trình nuơi cấy tái sinh) thì việc xác định mật độ protoplast thích hợp của các dịng trước khi dung hợp là rất quan trọng. Nếu mật độ protoplast quá thưa thì sự kết lắng của protoplast ít và sẽ bị mất trong quá trình dung hợp (khi hút bỏ PEG và dung dịch rửa dung hợp), nếu mật độ protoplast quá dầy thì số tế bào kết dính 2 ít và số tế bào kết dính 3, 4, … nhiều. Hơn nữa nếu mật độ protoplast của 2 dịng dung hợp khơng tương thích thì khả năng tạo tế bào lai giữa 2 dịng là rất ít. Chính vì vậy chúng tơi tiến hành thí nghiệm sử dụng các mật độ protoplast khác nhau để dung hợp thu hiệu quả cao nhất (xác định mật độ thơng qua việc
đếm protoplast bằng buồng đếm hồng cầu).
13
Hình 3.4: Ảnh hưởng của mật độ protoplast dung hợp tới hiệu suất của quá trình dung hợp của tổ hợp B186+B208 trình dung hợp của tổ hợp B186+B208
Đếm số protoplast chập đơi, chập ba sau khi dung hợp ở các mật độ
khác nhau trên một thị trường của vật kính 20. Ta cĩ bảng sau:
Bảng 1: Sự kết tập của protoplast sau khi dung hợp
Số tế bào dính Mật độ 2 (protoplast) 3 (protoplast) Mật độ 2 (protoplast) 3 (protoplast) 2.106 protoplast/ml 4 1 2,5.106 protoplast/ml 10 3 2,75.106 protoplast/ml 13 8 2.106 tế bào/1ml 2,5.106 tế bào/1ml 2,75.106 tế à /1 3.106 tế bào/1ml
14
3.106 protoplast/ml 9 14
Nhận xét:
Ở mật độ 2,106 protoplast/ml số cụm tế bào dính đơi ít nhất (4 cụm tế
bào) và lượng tế bào cịn lại sau quá trình dung hợp ít do các tế bào lắng
đọng kém nên bị hút bỏ trong quá trình hút bỏ dịch rửa dung hợp.
Với mật độ 2,75.106 protoplast/ml cho số cụm protoplast dính đơi nhiều nhất (13 cụm) tạo điều kiện cho dung hợp của hai tế bào xảy ra với tỷ nhiều nhất (13 cụm) tạo điều kiện cho dung hợp của hai tế bào xảy ra với tỷ
lệ cao.
Mật độ 3.106 protoplast/ml lại cho các cụm protoplast dính ba nhiều nhất, như vậy tỷ lệ xảy ra dung hợp của 3 protoplast với nhau tạo hexaploid cao trong như vậy tỷ lệ xảy ra dung hợp của 3 protoplast với nhau tạo hexaploid cao trong khi đĩ mục đích là tạo dihaploid.
Như vậy mật độ dung hợp 2,75.106 protoplast/ml là mật độ thích hợp nhất cho dung hợp bằng hố chất PEG, ở mật độ này thì cho số lượng nhất cho dung hợp bằng hố chất PEG, ở mật độ này thì cho số lượng protoplast dính đơi nhiều nhất (13 cụm). Tuy nhiên mật độ dung hợp 2,5.106 protoplast/ml cũng được coi là mật độ dung hợp thích hợp vì số lượng các tế
bào dính 2 nhiều nhưng so với mật độ 2,75.106 protoplast/ml thì tế bào cịn lại ít. ít.
Kết luận: mật độ protoplast thích hợp để dung hợp là 2,75.106ml/l .
2.3.6. Thí nghiệm 5: Xác định mơi trường nuơi thích hợp cho các tổ hợp lai sau dung hợp lai sau dung hợp
Các tế bào sau dung hợp PEG tiến hành nuơi cấy trên các mơi trường nuơi cấy VKMII, A*, KM8P*. cấy VKMII, A*, KM8P*.
Bảng 2. Thời gian xuất hiện phân chia tế bào trần sau dung hợp trên các trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau (ngày sau nuơi cấy). các trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau (ngày sau nuơi cấy).
15 Mơi trường Dịng VKMII A* KM8P* H1959/195+A16 4 5 6 A15+H1959/195 3 5 7 A16+B186 3 4 5 A41+A15 2 4 7 A56+A16 3 5 6 B186+B208 2 4 5 B186+1929/34 2 4 6
Hình 3.5 Hình ảnh phân chia tế bào sau 5 ngày nuơi cấy trên các mơi trường khác nhau. khác nhau.
.A. Tế bào trần của tổ hợp A15+A41 trên mơi trường VKMII; B. Tế bào trần của tổ hợp A15+A41 trên mơi trườngA*; C.Tế bào trần của tổ hợp A15+A41 trên mơi trường KM8P*; D. Tế bào trần của tổ hợp B208 +B186 trên mơi trường VKMII; E. Tế bào trần của tổ hợp B208 +B186 trên mơi trường A*; F. Tế bào trần của tổ hợp B208 +B186 trên mơi trường KM8P*.
Qua bảng 5 và các hình ảnh phân chia của tế bào sau 5 ngày nuơi cấy (hình 2) cho thấy: ảnh hưởng của các loại mơi trường khác nhau đến sự (hình 2) cho thấy: ảnh hưởng của các loại mơi trường khác nhau đến sự
phân chia của tế bào trần là rất rõ rệt.
Trên mơi trường A* và KM8P*, thời gian bắt đầu phân chia của tế
bào trần của các dịng khoai tây nghiên cứu là 4-5 ngày và 5-7 ngày tương
A B C
F
D
16
ứng. Tốc độ phân chia tế bào thấp và khơng đồng đều. Hầu như các tế bào trần khơng hình thành được microcallus và chết sau 10-14 ngày nuơi cấy. trần khơng hình thành được microcallus và chết sau 10-14 ngày nuơi cấy.
Các tế bào trần nuơi cấy trên mơi trường VKMII bắt đầu phân chia chỉ
sau 2-3 ngày nuơi cấy tùy thuộc vào dịng khoai tây nuơi cấy. Sau 3 ngày nuơi cấy, tồn bộ các dịng đều phân chia, tạo microcallus sau 2 tuần nuơi nuơi cấy, tồn bộ các dịng đều phân chia, tạo microcallus sau 2 tuần nuơi cấy. Các dịng khoai tây khác nhau cũng cĩ sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau trên mơi trường VKMII. Trong đĩ, các tổ hợp dung hợp A41+A15, B186+B208, B186+1929/34 cĩ sự phân chia sớm và hình thành microcallus sớm hơn cả chỉ sau 2 ngày nuơi cấy.
Như vậy, mơi trường VKMII là mơi trường thích hợp để nuơi cấy tạo microcallus của tế bào trần. microcallus của tế bào trần.
PHẦN IV. KẾT LUẬN