- Đã tìm ram ật độ tế bào thích hợp để dung hợp 2 dịng nhị bội là 2.75 Đã tìm ra mơi trường nuơi cấy thích hợ p cho các protoplast sau dung
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tái sinh các sản phẩm sau dung hợp
3.1. Kết quả tái sinh các sản phẩm sau dung hợp
Theo phương pháp dung hợp bằng xung điện của Thieme và cs (1997), chúng tơi đã dung hợp rất thành cơng các tế bào trần từ các tổ hợp bố mẹ khoai tây nhị bội. Các sản phẩm sau dung hợp được nuơi cấy và tái sinh theo quy trình của Mollers (1990), Nguyễn Quang Thạch và cs (1993) đã cho hàng loạt các cây tái sinh.
Bảng 4. Kết quả tái sinh cây từ callus sau dung hợp giữa các dịng khoai tây nhị bội Sự tái sinh các tổ hợp lai
STT Tổ hợp lai
Số lượng callus tạo thành (callus)
Số lượng cây tái sinh từ callus
(cây)
Tỷ lệ tái sinh cây (%) 1 A15+A56 1026 25 2,43 2 A15+B208 350 37 10,57 3 A16+B208 650 104 16,00 4 A56+A41 111 15 13,51 5 A56+B186 51 3 5,88 6 B186+B208 175 25 14,28 7 A41+A16 29 21 72,41 8 A16+A56 210 17 8,09 9 A16+B186 399 60 14,13 10 A15+A41 136 15 11,03 11 Tổng 3137 326 16,83
Kết quả tái sinh (bảng 4) cho thấy tỷ lệ tái sinh thành cây phụ thuộc vào các tổ hợp kiểu gen khác nhau. Tổ hợp A41+A16 cĩ tỷ lệ tái sinh cây/callus cao nhất, 21cây/29 callus đem tái sinh đạt 72,41%; tổ hợp A15+A56 cĩ tỷ lệ tái sinh cây/callus thấp nhất, đạt 2,43%. Từ 3137 callus của 10 tổ hợp dung hợp đem tái sinh cây thu được 326 cây, đạt tỷ lệ tái sinh trung bình là 17,62%.
3.2. Xác định độ bội của các con lai bằng máy Flow cytometry
Khi tiến hành dung hợp hỗn hợp tế bào trần của 2 dịng khoai tây nhị bội “bố”, “mẹ”, tế
bào trần của hai dịng được trộn lẫn theo tỷ lệ 1:1.Tùy thuộc vào số lượng tế bào trần tham gia dung hợp cĩ thể hình thành các thể tứ bội (2n=4x), lục bội (2n=6x),... và cả các thể hỗn bội. Khoai tây trồng là thể tứ bội (2n=4x). Việc xác định độ bội để tìm ra các dịng tứ bội là khâu đầu tiên trong việc xác định con lai soma. Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp flow cytometry để xác
7
Mẫu đối chứng chuẩn (2n=2x) Dịng bố mẹ (2n=2x)
Con lai tứ bội (2n=4x)
Con lai lục bội (2n=6x)
Kết quả phân tích flow cytometry các dịng bố mẹ chứa nhân 2C xuất hiện đỉnh 1 ở vị trí gần 200; Các dịng cĩ chưá nhân 4 C đỉnh 2 ở vị trí gần 400; các dịng cĩ chứa nhân 6C xuất hiện
ởđỉnh 3 ở vị trí gần 600. Các dạng khảm chứa hỗn hợp các tế bào cĩ nhân 2 C + 4 C xuất hiện 2
đỉnh 1 và 2 ở vị trí tương ứng là 200 và 400.
Hình 1. Kết quả phân tích độ bội của dịng khoai tây “bố mẹ” và con lai tái sinh bằng phương pháp dịng chảy tế bào (flow cytometry).
Bảng 5. Kết quả xác định độ bội các cây tái sinh sau dung hợp
Tổ hợp lai Số cây tái sinh
(cây) Tỷ(2n=2x) (%) lệ cây nhị bội T(2n= 4x) (%) ỷ lệ cây tứ bội Tỷ lbệộ cây hi (%) ỗn
A15+A41 15 33,33 46,67 20,00 A15+A56 25 28,00 52,00 20,00 A15+B208 37 27,03 35,13 37,84 A16+B208 104 10,58 28,85 60,58 A16+A56 17 29,41 52,94 17,65 A16+ A41 21 33,33 38,09 28,57 A16+B186 60 28,33 31,67 40,00 số lượng nhân tế bào Cường độ huỳnh quang số lượng nhân tế bào Cường độ huỳnh quang số lượng nhân tế bào Cường độ huỳnh quang số lượng nhân tế bào Cường độ huỳnh quang
8
A56+A41 15 26,67 40,00 33,33
A56+B186 7 14,29 42,86 42,86
B186+B208 25 20,00 80,00 0,00
Tổng 326 25,10 44,82 30,08
Kết quả bảng 5 cho thấy:từ 326 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ cĩ 128 cây cĩ độ bội 2n=4x (chiếm tỷ lệ 44,82%). Tỷ lệ cây tứ bội (2n=4x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 11 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp B186+B208 cĩ tỷ lệ con lai tứ bội cao nhất, đạt 80,00%; tổ
hợp A16+B186 cĩ tỷ lệ con lai tứ bội thấp nhất, đạt 28,85%.
Ngồi tỷ lệ cây tứ bội là phổ biến (44,82%), tỷ lệ cây cĩ độ bội lớn hơn 4x (lục bội, bát bội) chiếm tỷ lệ khá cao, 30,08% và cũng cĩ một tỷ lệ nhất định cây nhị bội (25,10%). Số cây nhị
bội tái sinh được từ các callus hình thành từ các tế bào trần khơng qua dung hợp.
Sử dụng máy flow cytometry đã xác định được 128/326 dịng là thể tứ bội. Cĩ thể phân các thẻ tứ bội thành dạng lai đồng nhân (homozygous hybrids) và dạng lai dị nhân (heterozygous hybrids). Mục tiêu của nghiên cứu cần tách được các thể lai dị nhân tứ bội (con lai soma).
3.2.Xác định các con lai soma bằng isozym và chỉ thị phân tử SSR
3.2.1.Xác định con lai soma bằng kỹ thuật isozym
Cĩ nhiều phương pháp để xác định con lai dị nhân, trong đĩ con đường cĩ khả năng nhất để
nhận biết thể lai mục tiêu là việc so sánh các protein thực vật đặc trưng cho mỗi kiểu gen. Cơ sở
của phương pháp là điện di protein, rồi nhận biết chúng thơng qua sự nhuộm mầu các isozym, dấu hiệu thể hiện là các vạch băng trên gel. Các kiểu gen khác nhau theo quy luật sẽ thể hiện sự sai khác trên các phổ “isozym mẹ”, sau khi dung hợp tế bào trần của 2 dịng khoai tây cĩ phổ
“isozym mẹ” khác nhau thì con lai sẽ cĩ phổ isozym là sự cộng lại phổ isozym của cả hai dịng “bố mẹ”.Trên cơ sở đĩ, chúng tơi tiến hành nghiên cứu phân tích hai hệ isozym esterase và peroxidase đối với các cây lai đã được xác định cĩ độ bội là tứ bội.
Kết quả phân tích isozym esteraza và peroxidaza cho thấy cả trong 11 tổ hợp dung hợp khơng cĩ tổ hợp nào cĩ thể xác định cây lai bằng phương pháp này. Nguyên nhân là do hai phổ
isozym của dịng “bố” và dịng “mẹ” khơng cĩ sự sai khác rõ rệt để cĩ thể tìm ra sự tổ hợp phổ
isozym của con lai tái sinh (Hình 2.1 và hình 2.2).
So sánh kết quả của thí nghiệm này với các thí nghiệm của các tác giả trước đây đã tiến hành cĩ thể cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của các kiểu genotyp khác nhau được chọn làm dịng “bố
mẹ” để dung hợp tế bào trần. Với các dịng “bố mẹ” cĩ sựđa hình rõ rệt thì sự tổ hợp phổ isozym của các thể lai là rõ ràng: chỉ với hai enzym esteraza và peroxidaza, trong 13 tổ hợp đem xác định
9
thì chỉ cĩ duy nhất 2 tổ hợp H88 1500/12+ H88 1512/4 và H88 1500/12+ H88 1512/28 là khơng thể xác định con lai bằng hệ 2 enzym này (Nguyễn Quang Thạch, 1993) trong khi cả 11 tổ hợp lai A15+A41, A15+A56, A15+B208, A16+B208, A16+A56, A16+ A41, A16+B186, A56+A41, A56+B186, B186+B208, B186+A16 đều khơng thể xác định được bằng hệ 2 enzym khá nhậy này.
Chú thích: P1: Dịng khoai tây nhị bội “bố” P2: Dịng khoai tây nhị bội “mẹ” H1 Ỉ H5: Các cây lai tứ bội
Hình 2.1. Hình ảnh xác định con lai soma bằng isozym peroxidaza A- Tổ hợp B186+B208; B- Tổ hợp A15+A56
Chú thích: P1: Dịng khoai tây nhị bội “bố” P2: Dịng khoai tây nhị bội “mẹ” H1 Ỉ H4: Các cây lai tứ bội
Hình 2.2. Hình ảnh xác định con lai soma bằng isozym esteraza A -Tổ hợp A15+A56 ; B- Tổ hợp B186+B208