C B186 (E1) D H1929/34 (E4)
“Nghiên cứu đánh giá quy trình dung hợp bằng xung điện các dịng khoai tây nhị bội phục vụ chương trình tạo giống khoai tây sạch bệnh virus”
2.2 Phương pháp nghiên cứu:
Tạo vật liệu in vitro: Các dịng khoai tây diploid được nuơi cấy in vitro trong mơi trường MS cĩ bổ sung thêm chất kháng etylen (STS) để tăng diện tích lá phù hợp, tạo nguyên liệu tách tế bào trần.
Cây in vitro được đặt trong phịng nuơi theo chếđộ nhiệt độ 210C, cường độ chiếu sáng 4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/8h tối.
Tách tế bào trần: Các lá của khoai tây in vitro 3-4 tuần tuổi được sử dụng làm nguyên liệu tách tế bào trần. Quy trình tách tế bào trần tiến hành theo Mollers và cs (1992), Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2012)
Dung hợp protoplast bằng xung điện: Quy trình dung hợp xung điện được tiến hành theo Thieme và cs (1997). Máy xung điện CFA 500 (Krüss GmbH, Hamburg) được sử dụng trong các thí nghiệm dung hợp xung điện. Quy trình dung hợp xung điện:
1. Trộn huyền phù tế bào trần của 2 dịng bố mẹ theo tỷ lệ 1:1 với mật độ thích hợp. 2. Khử trùng buồng xung điện bằng cồn 70%; hút 400 µl hỗn hợp tế bào trần trong dung dịch dung hợp (0,4M Manitol, 1mMCaCl2) vào buồng xung điện.
3. Khởi động máy xung điện với các thơng số
4. Tiến hành xung, sau khi chương trình ngừng lại, dùng pipette hút dịch protoplast vào đĩa petri (Ø = 3,5 cm) và bổ sung 1,8 ml mơi trường nuơi VKMII (Thieme và cs, 1997).
Nuơi cấy và tái sinh protoplast sau dung hợp
Các tế bào trần được nuơi cấy trong đĩa petri nhỏ (φ 3.5cm hoặc φ 5cm) với mơi trường lỏng phù hợp trong điều kiện tối 250C. Sau 3-4 tuần cĩ thể thấy các microcallus xuất hiện. Các microcallus này sẽ được cấy chuyển sang đĩa petri lớn (φ 9cm) chứa mơi trường cứng Cul-medium (Haberlach et al., 1985). Các đĩa petri này được đặt trong phịng nuơi với quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày, nhiệt độ là 220C.
Sau 3-8 tuần cĩ thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang mơi trường tái sinh RJM (Mưllers và Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuơi cấy macrocallus. Khoảng 8-12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được chuyển sang mơi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hồn chỉnh.
Phương pháp xác định độ bội: Độ bội của cây tái sinh từ tế bào trần sau dung hợp được xác định bằng máy flow cytometry.
2.3 Các chỉ tiêu theo dõi
- Chất lượng tế bào sau dung hợp
- Thời gian xuất hiện hiện tượng phân chia và chất lượng tế bào phân chia - Sự kết gắn tạo hàng của tế bào trong quá trình dung hợp.
- Thời gian và khả năng tạo microcallus của các tổ hợp dung hợp. - Số lượng macrocallus/ đĩa peptri trên mơi trường tạo macrocallus. - Tỷ lệ callus tái sinh chồi = số callus tái sinh chồi/tổng số callus - Tỷ lệ cây 4x tái sinh = số cây 4x/tổng số cây tái sinh
- Tỷ lệ cây 6x tái sinh = số cây 6x/tổng số cây tái sinh
Tổng cộng 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào, sự hình thành microcallus, sự hình thành macrocallus từ microcallus và tái sinh cây từ macrocallus.