ADN tổng số được kiểm tra độ nguyên vẹn trên gel agarose 1%. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 3%.
Bản gel sau khi chạy được nhuộm bằng Ethidium bromide và được chụp hiện hình bằng tia UV.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
- Kết quả test ELISA được đọc bằng máy đọc ở bước sĩng 405nm, sau đĩ được tính theo cơng thức: ODn ODs N S = ODs: giá trị OD của mẫu ODn: giá trị OD của đối chứng âm - Nếu tỷ lệ n s >2 thì kết luận mẫu bị nhiễm virus. - Nếu tỷ lệ n s
4
PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng virus PVY, PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo 3.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng virus PVY, PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo
Kiểm tra virus trên con lai soma và bố mẹ bằng DAS – ELISA. Kết quảđược hiển thị trong bảng
Bảng 2: Kết quả test Elisa kiểm tra tính kháng virus PVX các con lai và bố mẹ trước khi lây nhiễm nhân tạo
Tên dịng
s/n= (OD của mẫu)/ (OD đối chứng
âm) Kết quả
A41 <2 Khơng nhiễm
A15 <2 Khơng nhiễm
A16 <2 Khơng nhiễm
B186 <2 Khơng nhiễm B208 <2 Khơng nhiễm H76 <2 Khơng nhiễm H79 <2 Khơng nhiễm H21-1 <2 Khơng nhiễm H81-1 <2 Khơng nhiễm ĐC (+) out Nhiễm ĐC (-) <2 Khơng nhiễm ĐC (+): Đối chứng dương ĐC (-): đối chứng âm
Bảng 3. Trình tự sắp xếp của các mẫu khoai tây vào giếng ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A A15 A15 A41 A41 A16 A16 B186 B186 B208 B208 H76
B H76 H79 H79 H21-1 H21-1 H81-2 H81-2 1 1 2 2 C 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 D 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 E 14 14 15 15 16 16 17 17 (+) (+) (-) F (-) 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 G 23 23 24 24
5Kết luận: Kết luận:
Bốn con lai soma giống bố mẹ khơng bị nhiễm virus PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo.. Bảng 4. Kết quả test Elisa kiểm tra tính kháng virus PVY của các dịng lai và bố mẹ trước khi lây nhiễm nhân tạo
Tên dịng
s/n= (OD của mẫu)/ (OD đối chứng âm)
Nhiễm hay khơng nhiễm
PA41 <2 Khơng nhiễm
PA15 <2 Khơng nhiễm
PA16 <2 Khơng nhiễm
PB186 <2 Khơng nhiễm PB208 <2 Khơng nhiễm H76 <2 Khơng nhiễm H79 <2 Khơng nhiễm H21-1 <2 Khơng nhiễm H81-1 <2 Khơng nhiễm ĐC (+) out Nhiễm ĐC (-) <2 Khơng nhiễm ĐC (+): Đối chứng dương ĐC (-): đối chứng âm
Bảng 5. Trình tự sắp xếp của các mẫu khoai tây vào giếng ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
6
B PA15 PA15 PA41 PA41 PA16 6 PA1 PB186 PB186 PB208 PB208 H76 H76 C H79 H79 H21-1 H21-1 H81-2 H81-2 + + - - 1 1 C H79 H79 H21-1 H21-1 H81-2 H81-2 + + - - 1 1 D 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 E 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 F 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 G 20 20 H
Kết luận: Bốn con lai soma giống bố mẹ khơng bị nhiễm virus PVY trước khi lây nhiễm nhân tạo.
3.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng virus PVY thơng qua lây nhiễm nhân tạo
Một số gen kháng PVY Rysto (Ross, 1958), Rychc (Hosaka et al. 2001), Ryadg (Hämäläinen et al, 1997) đã được sử dụng đểđánh giá khả năng kháng virus PVY của các dịng khoai tây trồng (Ye-Su Song et al, 2005; Ye-Su Song et al, 2008; Kazuyuki Mori et al, 2011). Kết quả cho thấy, mặc dù chứa kháng gene PVY nhưng các dịng khoai tây thử nghiệm lại cĩ mức độ kháng khác nhau với các chủng virus khi lây nhiễm nhân tạo. Do vậy, đểđánh giá khả năng kháng virus PVY một cách đầy đủ và chính xác, nghiên cứu đã tiến hành lây nhiễm nhân tạo các con lai soma và "bố mẹ" với 5 chủng virus PVY. Trong đĩ hai chủng virus PVY-N, PVY-O cĩ mức độ tương
đồng cao (lần lượt là 98,8%, 99,7%) với các chủng virus được phân lập tại Việt Nam (Cuong Ha et al, 2008). Kết quảđược thể hiện ở bảng 1:
Bảng 6. Tỷ lệ nhiễm của các dịng lai soma và ”bố mẹ” khi lây nhiễm nhân tạo bằng 5 chủng virus PVY
7 NTN NTN bội N/B % N/B % N/B % N/B % N/B % A15 2x 0/4 0 0/4 0 1/4 25 0/4 0 0/4 0 A41 2x 0/4 0 3/4 75 1/3 33 3/4 75 4/4 100 B208 2x 0/4 0 0/4 0 0/4 0 1/4 25 0/4 0 B186 2x 3/4 75 4/4 100 1/4 25 4/4 100 0/4 0 A16 2x 0/4 0 0/4 0 4/4 100 0/4 0 0/4 0 H76 4x 0/4 0 1/4 25 0/4 0 1/4 25 2/4 50 H79 4x 0/4 0 1/4 25 0/4 0 0/4 0 2/4 50 H21-1 4x 2/4 50 2/4 50 3/4 75 4/4 100 2/4 50 H81-2 4x 0/4 0 0/4 0 4/4 100 1/4 25 0/4 0
Chú thích: N/B- Số cây bị nhiễm/số cây lây nhiễm. H76 là con lai soma của tổ hợp A15+A41 H79 là con lai soma của tổ hợp A15+A41 H8-12 là con lai soma của tổ hợp A16+B186 H21-1 là con lai soma của tổ hợp B186+B208
Kết quả bảng 6 cho thấy: các dịng lai soma đã tổ hợp được tính kháng của dịng nhị bội ”bố mẹ” đồng thời nâng cao mức kháng so với ban đầu.
Dịng nhị bội A41 kháng kém với hai chủng virus PVY-Wilga, PVY-NTN (75% số cây bị
nhiễm) và mẫn cảm với chủng PVY-NA-NTN (100% cây bị nhiễm) nhưng khi dung hợp với dịng A15 cĩ khả năng kháng cao với 3 chủng PVY-Wilga, PVY-NTN, PVY-NA-NTN (100% cây khơng bị nhiễm) tạo ra con lai H76, H79 kháng cao đến trung bình với 3 chủng virus đĩ (chỉ cĩ 25-50% cây bị nhiễm), đặc biệt H79 lại kháng hồn tồn với chủng PVY-NTN (0% cây bị
nhiễm).
Dịng nhị bội B186 mẫn cảm với PVY-Wilga, PVY-NTN (100% cây bị nhiễm) và kháng kém PVY-O (75% cây bị nhiễm) được dung hợp với dịng B208 (kháng cao với PVY-Wilga, PVY-NTN và PVY-O (100% cây khơng bị nhiễm)) để tạo ra con lai H21-1 cĩ khả năng kháng vừa với 2 chủng virus PVY-Wilga, PVY-O (chỉ 50% cây bị nhiễm). Con lai H81-2 của tổ hợp B186+A16 cũng cĩ sự tổ hợp tính kháng của hai dịng bố mẹ, H81-2 kháng cao với PVY-O,
PVY-Wilga, PVY-NA-NTN (100% cây khơng bị nhiễm) và kháng vừa PVY-NTN (25% cây bị
nhiễm).
Từ bảng kết quả lây nhiễm nhân tạo cho thấy: trong 4 dịng con lai soma thì H79, H76, H81-2 là ba dịng cĩ khả năng kháng cao đến kháng vừa với 5 chủng virus. Đặc biệt hai con lai
8
soma H79, H76 cĩ khả năng kháng cao với hai chủng virus PVY-O, PVY-N là hai chủng phổ biến
ở Việt Nam với tỷ lệ 100 % mẫu kiểm tra khơng bị nhiễm.
3.3. Đánh giá khả năng kháng virus của các con lai soma và các dịng bố mẹ của chúng thơng qua chỉ thị phân tử thơng qua chỉ thị phân tử
Trong genom khoai tây người ta đã phát hiện cĩ một số loại gen cĩ khả năng kháng lại bệnh virus Y, đĩ là lồi S. stolonierum cĩ chứa gen Rysto , Rystona , Rystorns; lồi S.tuberosum
spp.Andigena cĩ chứa Ryadg; lồi S.demisum cĩ chứa gen Nydms; lồi S.hougasi cĩ chứa gen Ryhou
... Trong các gen kháng PVY, gen Rysto là một gen cĩ nguồn gốc từ lồi S. stolonierum cho khả
năng kháng rất cao đối với tất cả các chủng PVY. Hơn nữa hơng chỉ kháng PVY mà gen Rysto cịn
cho phép các dịng, giống khoai tây chứa nĩ kháng được một số loại virus khác nữa như PVA, PVV. Vì vậy gen này được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm.
Ye-Su Song và cộng sự (2005) đã sử dụng 12 mồi AFLP và phân tích trên 106 mẫu giống khoai tây cĩ nguồn gốc từĐức, Hà Lan, Ba Lan đểđịnh vị gen Pysto và kết luận locus của gen Ry-
sto nằm ở trên nhiễm sắc thể XII và được phát hiện bởi mồi SSR STM0003 – 111. Mồi STM 003 - 111 nhân đoạn ADN cĩ kích thước 111bp cùng nằm trên NST XII và liên kết rất chặt với gen Ry-
sto.
Gen Nb là một gen trội cho phép khoai tây cĩ khả năng kháng cao với các chủng PVX thuộc nhĩm 1 (chủng PVX ROTH1), nhĩm 2 (chủng PVY CP2). Marano và cộng sự (2002) đã xác định được vị trí của gen Nb nằm ở vị trí 0.76 cM trên NST số V, giữa 2 marker AFLP GM339, GM637. Marker GM339 nhân đoạn ADN cĩ kích thước 330bp liên kết rất chặt với gen Nb.
Từ những kết quả thu thập ở trên chúng tơi đã sử dụng mồi GM3339 để phát hiện ra gen kháng virus PVX, mồi STM0003-111 để phát hiện ra gen kháng PVY.
Kết quả phản ứng PCR được thể hiện ở sự xuất hiện các băng ADN trên bản gel điện di. Mỗi đoạn ADN được nhân lên sẽ cho 1 vạch cĩ vị trí nhất định trên bản gel. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR được minh họa ở hình 1. Qua kết quả phản ứng PCR ta thấy:
- Khi sử dụng mồi GM339, những dịng khoai tây cĩ đoạn ADN được nhân lên với kích thước 330bp, đúng như kích thước của đoạn ADN liên kết chặt với gen Nb - gen kháng virus