Nhận xét đặc điểm mô bệnh học và bộc lộ thụ thể yếu tố phát triển biểu bì trong ung thư biểu mô tuyến của phổi

Màng phổi được tạo thành bởi một lớp mô liên kết xơ mỏng, trong đó có những tế bào sợi và đại thực bào, những bó sợi chun chạy dọc theo các hướng khác nhau và được lợp bởi một lớp trung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Tôi xin trân trọng và chân thành cảm ơn

PGS.TS Nguyễn Văn Hưng, trưởng bộ môn Giải phẫu bệnh, cùng các thầy cô trong bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luân văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học và Bộ môn GPB Trường Đại Học Y Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Khoa GPB - Tế bào Bệnh viện K Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm đề tài

PGS.TS Trịnh Tuấn Dũng, trưởng khoa GPB, cùng các cán bộ nhân viên khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện TW quân đội 108 đã giúp tôi kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch trong nghiên cứu luận văn này

Gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố

Tác giả

Phùng Quang Thịnh

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BN: Bệnh nhân

EGFR: Epidermal growth factor receptor

(thụ thể yếu tố phát triển biểu bì )

GPB: Giải phẫu bệnh

KN – KT Kháng nguyên – kháng thể

HE: Hematoxyline Eosine

NSCLC Non small cell lung cancer

(ung thư phổi không tế

bào nhỏ )

MBH: Mô bệnh học

TCYTTG: Tổ chức y tế thế giới

TKNT: Thần kinh nội tiết

UTBM: Ung thư biểu mô

UTBMT: Ung thư biểu mô tuyến

UTP: Ung thư phổi

NOS Not otherwise specified (không đặc biệt)

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17

1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ HỌC CỦA PHỔI 17

1.1.1 Thuỳ phổi và tiểu thuỳ phổi 17

1.1.2 Phần dẫn khí trong phổi - cây phế quản 17

1.1.3 Phần hô hấp của phổi 20

1.1.4 Màng phổi 24

1.2 PHÂN LOẠI MÔ BỆNH HỌC UTP 25

1.2.1 Một số phân loại mô bệnh học UTP 25

1.2.2 Đặc điểm MBH các phân týp và các biến thể của UTBMT của phổi 31

1.3 CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA EGFR 34

1.3.1 Cấu trúc của EGFR 34

1.3.2 Chức năng của EGFR 36

1.4 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN EGFR 38

1.4.1 Kỹ thuật hoá mô miễn dịch 38

1.4.2 Kỹ thuật sinh học phân tử 40

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN EGFR VÀ ĐIỀU TRỊ ĐÍCH TRÊN THẾ GIỚI 42

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 47

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 47

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 47

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 47

2.2.2 Cỡ mẫu 47

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 47

2.2.4 Ghi nhận một số đặc điểm lâm sàng 47

2.2.5 Phân loại TNM và xếp giai đoạn UTP 47

2.2.6 Nghiên cứu MBH 49

2.2.7 Nghiên cứu yếu tố phát triển biểu bì bằng HMMD 50

2.2.8 Xử lý số liệu 53

2.2.9 Phương pháp thống kê 53

2.2.10 Khía cạnh đạo đức của đề tài 53

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 KẾT QUẢ MÔ BỆNH HỌC 54

3.1.1 Phân bố bệnh nhân theo tuổi, giới 54

3.1.2 Vị trí u trên X quang 55

3.1.3 Kích thước u 57

3.1.4 Tình trạng hạch vùng 58

3.1.5 Đánh giai giai đoạn bệnh 59

3.1.6 Phân loại MBH theo TCYTTG 1999 60

3.1.7 Liên quan giữa vị trí và kích thước u 67

3.1.8 Liên quan kích thước u và di căn hạch vùng 67

3.1.9 Liên quan vị trí u và di căn hạch vùng 68

3.2 KẾT QUẢ HOÁ MÔ MIỄN DỊCH 68

3.2.1 Bộc lộ EGFR 68

3.2.2 Bộc lộ EGFR với giai đoạn UTBMT phổi 71

3.2.3 Bộc lộ EGFR với các phân týp UTBMT phổi 72

3.2.4 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với giới 73

3.2.5 Liên quan giữa bộc lộ EGFR tuổi 73

3.2.6 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với di căn hạch vùng 74

3.2.7 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với kích thước u 74

3.2.8 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với vị trí u 75

Chương 4: BÀN LUẬN 76

4.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ MBH UTBMT CỦA PHỔI 76 4.2 VỀ SỰ BỘC LỘ EGFR TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN CỦA PHỔI 83

KẾT LUẬN 89 KIẾN NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo tuổi, giới 54

Bảng 3.2 Vị trí u trên X quang 55

Bảng 3.3 Kích thước u 57

Bảng 3.4 Phân bố bệnh nhân theo tình trạng hạch vùng 58

Bảng 3.5 Đánh giai giai đoạn u theo TNM 59

Bảng 3.6 Phân loại mô bệnh học 60

Bảng 3.7 Liên quan giữa vị trí và kích thước u 67

Bảng 3.8 Liên quan kích thước u và di căn hạch vùng 67

Bảng 3.9 Liên quan vị trí u và di căn hạch vùng 68

Bảng 3.10 Tỷ lệ bộc lộ EGFR 68

Bảng 3.11 Bộc lộ EGFR với giai đoạn UTBMT phổi 71

Bảng 3.12 Bộc lộ EGFR theo các phân týp UTBMT phổi 72

Bảng 3.13 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với giới 73

Bảng 3.14 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với tuổi 73

Bảng 3.15 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với di căn hạch vùng 74

Bảng 3.16 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với kích thước u 74

Bảng 3.17 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với vị trí u 75

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong nước và trên thế giới 79

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 54

Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh theo giới 55

Biểu đồ 3.3 Kích thước u 57

Biểu đồ 3.4 Phân bố bệnh nhân theo tình trạng hạch vùng 58

Biểu đồ 3.5 Đánh giai giai đoạn u theo TNM 1997 59

Biểu đồ 3.6 Phân loại mô bệnh học 60

Biểu đồ 3.7 Bộc lộ EGFR với giai đoạn UTBMT phổi 71

Biểu đồ 3.8 Bộc lộ EGFR theo các phân týp UTBMT phổi 72

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng cặp đôi EGFR và sự gắn kết các phối tử 36

Hình 1.2 Cấu trúc các vùng chính của EGFR 37

Hình 3.1 Vị trí u trên X quang 56

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 3.1: UTBMT chùm nang HE x 400.BVK10- 37034 62

Ảnh 3.2: UTBMT nhú HE x400.BVK11-67066 62

Ảnh 3.3: UTBMT tiểu phế quản phế nang không chế nhày HE x 400 BVK11-73121 63

Ảnh 3.4: UTBMT đặc chế nhày HE x 400 BVK 55543 63

Ảnh 3.5: UTBMT hỗn hợp HE x 100 BVK10-53677 64

Ảnh 3.6: UTBMT thai biệt hoá cao HE x 400.BVK10-52263 64

Ảnh 3.7: UTBMT nhày "dạng keo" HE x 400 BVK11-52581 65

Ảnh 3.8: UTBMT nang nhày HE x 100 BVK09-7651 65

Ảnh 3.9: UTBMT tế bào nhẫn HE x 100 BVK10-30771 66

Ảnh 3.10: UTBMT tế bào sáng HE x 400 BVK11-64307 66

Ảnh 3.11: UTBMT phản ứng âm tính với EGFR Nhuộm EGFR x 400, BVK10-36325 69

Ảnh 3.12: UTBMT phản ứng dương tính 1+ với EGFR Nhuộm EGFR x 400, BVK11-75315 69

Ảnh 3.13: UTBMT phản ứng dương tính 2+ với EGFR Nhuộm EGFR x 400, BVK11-62258 70

Ảnh 3.14: UTBMT phản ứng dương tính 3+ với EGFR Nhuộm EGFR x 400, BVK09-27266 70

DANH SÁCH BỆNH NHÂN

Tuổi - Giới STT Họ Và Tên

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi (UTP) hay ung thư biểu mô phế quản là u ác tính phát sinh

từ phế quản, tiểu phế quản tận, phế nang hoặc từ các tuyến phế quản Đây là một loại ung thư gây tử vong hàng đầu trong các bệnh ung thư ở nhiều nước trên thế giới Số các trường hợp UTP đã gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây Bệnh thường xảy ra ở người trên 40 tuổi, hơn 80% bệnh nhân UTP có tiền sử hút thuốc lá, UTP là loại ung thư có độ ác tính cao, tiến triển nhanh, tiên lượng xấu [23]

Theo nhiều nghiên cứu đã công bố trên thế giới, ung thư biểu mô tuyến (UTBMT) gặp ở cả người hút thuốc lá và không hút thuốc lá và là týp UTP thường gặp nhất, chiếm 30% UTP, đặc biệt tăng nhanh ở nữ giới[34] Trước đây, UTBM vảy là týp UTP hay gặp nhất Tuy nhiên, từ khoảng thập niên 80 của thế kỷ 20 tỷ lệ UTBM vảy đã giảm xuống rõ rệt và hiện nay, UTBMT vươn lên vị trí hàng đầu [32]

Mặc dù UTBMT đã biết đến từ rất lâu, đã hiện diện trong phân loại mô bệnh học UTP ngay từ những phân loại đầu tiên công bố trên y văn thế giới, song bản chất bệnh học của nó còn đang được nghiên cứu Týp mô bệnh học (MBH) của UTBMT rất đa dạng và phức tạp vì nó có nhiều phân týp nhỏ, có thể nhầm lẫn Vì vậy, việc nghiên cứu đặc điểm MBH cũng như biến đổi gen của UTBMT phổi có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán xác định và đánh giá tiên lượng bệnh

Một trong những gen đang được nghiên cứu sâu trong những năm gần đây đó là gen mã hoá thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal growth factor receptor – EGFR ) Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì gồm 4 thành viên : HER1, HER2, HER3, và HER4 EGFR hay HER1 là thụ thể Tyrosine Kinase

nằm trên bề mặt tế bào, là một glycoprotein bề mặt màng, trọng lượng phân tử

170 kDaltons (kDa), gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào, một vùng xuyên màng đặc hiệu và một vùng trong tế bào [14] EGFR được kích hoạt khi gắn kết với các phối tử đặc hiệu như yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) hay yếu tố tăng trưởng chuyển dạng anpha (TGFα) [45] EGFR tăng cao trong tế bào ung thư là một yếu tố quan trọng thúc đẩy sự phát triển

tế bào u, ngăn chặn sự chết theo chương tình (apoptosis) và tạo thuận lợi cho tiến trình di căn theo các cơ chế khác nhau Mục đích nghiên cứu gen này là tìm ra thuốc điều trị đích phân tử [40]

Bộc lộ quá mức gen EGFR ở các khối u nói chung và ung thư phổi nói riêng liên quan đến hậu quả xấu trên lâm sàng Các thuốc ức chế EGFR – Tirosine Kinase đã được chứng minh hiệu quả trong điều trị những bệnh nhân UTP không tế bào nhỏ đã thất bại với hoá trị trước đó [17]

Tại Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học ung thư phổi Tuy nhiên theo hiểu biết của chúng tôi chưa thấy tác giả nào đi sâu nghiên cứu riêng mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến, đặc biệt là

sự bộc lộ EGFR của týp này Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục đích:

1 Mô tả đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến của phổi

2 Xác định tần xuất bộc lộ thụ thể yếu tố phát triển biểu bì và mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến phổi

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM MÔ HỌC CỦA PHỔI

Phổi là cơ quan nội tạng, nằm trong lồng ngực nhưng lại mở thông với môi trường bên ngoài để đảm nhiệm chức năng trao đổi khí Bởi vậy, phổi có cấu tạo khá phức tạp

1.1.1 Thuỳ phổi và tiểu thuỳ phổi

Phổi là cơ quan đôi, được treo vào mỗi nữa lồng ngực bởi các cuống phổi và các dây chằng, cách nhau bởi tim và các thành phần khác của trung thất Vì tim ở vị trí lệch trái nên phổi phải lớn hơn phổi trái Phổi phải

có 3 thuỳ, phổi trái có 2 thuỳ Mỗi thuỳ lại được chia thành nhiều khối hình

tháp giới hạn bởi những vách liên kết mỏng, được gọi là những tiểu thùy phổi

Đỉnh các tiểu thuỳ phổi hướng về phía rốn phổi, đáy hướng về phía mặt phổi

Mặt ngoài phổi được bọc bởi lá tạng của màng phổi Ở trẻ sơ sinh và những năm tháng đầu cuộc đời, phổi có màu hồng sáng Theo tuổi đời phổi ngày càng ngả màu xám, đặc biệt là phổi của những người sống ở những vùng có nhiều bụi (thành phố, hầm mỏ) và người hút nhiều thuốc lá, là do các phần tử bụi khi hít vào, bị các đại thực bào ở phổi thâu tóm, tích lại ở vách các phế nang

1.1.2 Phần dẫn khí trong phổi - cây phế quản

Mỗi phế quản gốc khi rời rốn phổi sẽ chia nhánh nhỏ dần đi vào trong

phổi Toàn bộ các nhánh phân chia từ một phế quản gốc được gọi là cây phế quản Cách phân chia của cây phế quản như sau: ở bên phải, phế quản gốc chia thành 3 phế quản thuỳ đi tới 3 thuỳ phổi; ở bên trái, phế quản gốc chia

thành 2 phế quản thuỳ đi tới 2 thuỳ phổi Những phế quản thuỳ tiếp tục chia

nhánh nhiều lần hình thành những phế quản gian tiểu thuỳ Nhánh nhỏ khi đi vào mỗi tiểu thuỳ phổi được gọi là tiểu phế quản Trong mỗi tiểu thuỳ phổi,

tiểu phế quản tiếp tục chia nhánh nhỏ hơn Nhánh nhỏ nhất của phần dẫn khí

trong tiểu thuỳ phổi được gọi là tiểu phế quản tận Trong mỗi tiểu thuỳ phổi

có khoảng từ 50-80 tiểu phế quản tận, cả hai bên phổi có khoảng 20.000 tiểu phế quản tận

Những phế quản

Cấu tạo của thành các phế quản không hoàn toàn giống nhau trong suốt chiều dài của cây phế quản Chúng dần dần có sự thay đổi cùng với sự nhỏ đi của đường kính Tuy nhiên, các phế quản từ lớn đến nhỏ đều có cấu tạo đại cương giống nhau Thành của các phế quản từ trong ra ngoài đều có bốn lớp áo

Niêm mạc: có nếp gấp làm cho lòng của các phế quản nhăn nheo

- Biểu mô niêm mạc các phế quản thuộc loại biểu mô trụ giả tầng có lông chuyển Ở những phế quản có kích thước lớn (phế quản gốc, phế quản thuỳ, phế quản gian tiểu thuỳ), biểu mô niêm mạc giống biểu mô niêm mạc khí quản

- Lớp đệm được tạo thành bởi mô liên kết thưa, có đủ các loại sợi của

mô liên kết, đặc biệt có nhiều sợi chun, có ít tế bào lympho

Lớp cơ

Được tạo thành bởi 2 lớp cơ mỏng Lớp trong là lớp đặc, được tạo bởi những sợi cơ hướng vòng Lớp ngoài gồm những sợi cơ riêng biệt hướng dọc, lớp này không được thể hiện rõ ràng Cả hai lớp này bao bọc quanh ống phế

quản, gọi là cơ Reissessen, thuộc loại cơ trơn Các sợi cơ trong lớp cơ được

kết hợp chặt chẽ với những sợi chun Các bó cơ không bao giờ hình thành một vòng khép kín chung quanh ống phế quản

Lớp sụn và tuyến (lớp dưới niêm mạc)

Trong lớp này có những mảnh sụn trong, kích thước không đều, bao quanh thành phế quản Các mảnh sụn bé dần theo kích thước phế quản và mất

đi khi đường kính của tiểu phế quản còn < 1mm

Những tuyến trong lớp này thuộc loại tuyến nhầy và tuyến pha Ống bài xuất của chúng mở thẳng vào trong lòng phế quản Chất tiết của những tuyến

đó cùng với chất tiết của những tế bào hình đài tiết nhầy ở lớp biểu mô lớp niêm mạc làm mặt niêm mạc luôn luôn ẩm ướt và có khả năng giữ lại những hạt bụi, sau đó đẩy chúng ra ngoài

- Lớp niêm mạc: có nhiều nếp gấp làm cho lòng tiểu phế quản có hình như mặt cắt ngang quả khế, cấu tạo gồm:

+ Biểu mô: ở đoạn đầu tiểu phế quản thuộc biểu mô trụ đơn có lông chuyển, còn ở đoạn cuối thuộc loại biểu mô vuông đơn có hoặc không có lông chuyển Số lượng tế bào tiết nhầy ở biểu mô giảm nhiều, tuy nhiên vẫn có tế bào Clara, tế bào mâm khía và tế bào nội tiết

+ Lớp đệm: là một lớp mô liên kết mỏng có những loại sợi liên kết

nhưng chủ yếu là sợi chun

- Lớp cơ (hay còn gọi là cơ niêm): ở thành tiểu phế quản tương đối phát triển Vì vậy, sự co rút kéo dài của lớp này trong trường hợp bệnh lý (bệnh hen phế quản) làm cho lòng của tiểu phế quản bị co hẹp lại, gây khó thở thì thở ra

Tiểu phế quản tận

Tiểu phế quản tận là đoạn cuối cùng của cây phế quản, có đặc điểm:

- Thành khá mỏng

- Niêm mạc không có nếp gấp

- Biểu mô lợp thuộc loại biểu mô vuông đơn

1.1.3 Phần hô hấp của phổi

Tiểu phế quản hô hấp

Mỗi tiểu phế quản tận phân chia thành hai hoặc nhiều tiểu phế quản hô hấp Mỗi tiểu phế quản hô hấp lại tiếp tục phân đôi hai lần nữa, kết quả là có những tiểu phế quản hô hấp từ bậc 1 đến bậc 3 Tiểu phế quản hô hấp có hai chức năng chính vừa dẫn khí vừa trao đổi khí Đường kính của tiểu phế quản

hô hấp khoảng 0,4mm Thành của chúng có cấu tạo gần giống như tiểu phế quản tận: biểu mô vuông đơn tựa trên màng đáy, gồm những tế bào có lông chuyển và tế bào Clara Dưới biểu mô là những sợi chun chạy theo chiều dài

và các bó sợi cơ trơn chạy theo hướng xoắn ốc Đặc điểm cấu tạo của thành tiểu phế quản hô hấp là có những nơi phình ra, đó là những phế nang có chức năng trao đổi khí Ở đoạn đầu, thành tiểu phế quản hô hấp có ít phế nang, ở đoạn càng xa số phế nang càng nhiều hơn Biểu mô vuông đơn của thành tiểu phế quản hô hấp tiếp nối với biểu mô lát đơn của phế nang

Ống phế nang, tiền đình phế nang, túi phế nang

Mỗi tiểu phế quản hô hấp tiếp tục phân thành 2-10 ống phế nang Ống phế nang là đoạn ống mà thành của chúng có các phế nang độc lập đứng cạnh nhau và những phế nang kết thành chùm (túi phế nang) có miệng chung là tiền đình phế nang Nơi này, thành ống phế nang như bị gián đoạn Những đoạn thành ống phế nang còn lại được lót bởi biểu mô vuông đơn tựa trên màng đáy Dưới biểu mô là một lớp sợi collagen, sợi võng, rất giàu sợi chun

và những sợi cơ trơn Đây là những cơ kiểm soát đường khí ra vào phế nang

và túi phế nang Miệng các phế nang độc lập và các tiền đình có hình vòng, chúng tạo nên thành của ống phế nang và chính là phần đỉnh của các vách phế

Giữa các phế nang có những lỗ với đường kính khoảng 10-15μm

Bề mặt trong của thành phế nang được lợp bởi một biểu mô đặc biệt

rất mỏng, nằm trên màng đáy gọi là biểu mô hô hấp Lớp biểu mô hô hấp ở

thành phế nang được phân cách với biểu mô của thành phế nang bên cạnh bởi

một vách liên kết mỏng gọi là vách gian phế nang Trong vách gian phế nang

có một lưới mao mạch dày đặc gọi là lưới mao mạch hô hấp Những lỗ ở vách

gian phế nang cho phép không khí chuyển từ phế nang này sang phế nang bên cạnh tránh hiện tượng xẹp phế nang khi một số phế nang bị tắc Đồng thời,

những lỗ phế nang cũng tạo điều kiện thuận lợi lan truyền vi khuẩn trong các trường hợp viêm phổi

Biểu mô lợp phế nang (hay biểu mô hô hấp)

Biểu mô lợp phế nang được tạo bởi hai loại tế bào:

- Tế bào phế nang loại I là loại tế bào dẹt, chiếm đa số trong biểu mô hô hấp Vùng trung tâm của tế bào phình lên và chứa một nhân dẹt Lớp bào tương của tế bào mỏng không thể nhìn được dưới kính hiển vi quang học (do đó, khi chưa có kính hiển vi điện tử, biểu mô hô hấp được xem như bị đứt đoạn)

Khi nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử, người ta thấy tế bào biểu mô lợp thành phế nang là một lớp liên tục nằm trên màng đáy, có chiều dày không vượt quá 0,1μm Mặt ngoài màng đáy của biểu mô là màng đáy của lớp nội mô mao mạch hô hấp Các tế bào biểu mô lợp thành phế nang có nhiều nhánh bào tương dài 20-80nm, làm cho diện tích tiếp xúc của biểu mô hô hấp

và không khí tăng lên rất nhiều Trong bào tương của tế bào có những ti thể hình cầu, đường kính 0,2-0,4μm; những không bào lớn, đường kính 1-2μm

- Tế bào phế nang loại II:

Là những tế bào lớn Dưới kính hiển vi quang học, tế bào phế nang loại

II có hình cầu lớn, đơn độc hoặc nằm thành từng đám 2-3 tế bào lồi vào trong lòng phế nang

Dưới kính hiển vi điện tử, người ta nhận thấy những tế bào phế nang loại II là những tế bào biểu mô cùng nằm trên màng đáy với tế bào phế nang loại I nhưng có tính chất chế tiết nên chúng còn được gọi là những tế bào chế tiết Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao ngắn Trong bào tương có nhiều lưới nội bào có hạt, nhiều ribosom, ti thể, bộ Golgi, nhiều không bào Ngoài ra trong bào tương của những tế bào này còn có những hạt đặc Những

hạt này được tạo thành bởi những lá mảnh song song hay đồng tâm chứa nhiều phospholipid dưới dạng phức hợp lipoprotein, khi được bài xuất ra khỏi

tế bào, chúng trở thành một chất dịch phủ trên bề mặt biểu mô lợp phế nang gọi là chất phủ (surfactante) Chất phủ này có đặc tính làm giảm sức căng bề mặt giúp cho đường kính phế nang luôn được ổn định Nói cách khác, chất phủ điều chỉnh sức căng bề mặt phế nang trong quá trình hô hấp, ngăn không cho các phế nang xẹp lại Chất phủ luôn luôn được đổi mới Sự chế tiết của chất phủ được điều hoà bởi thần kinh

- Đại thực bào phế nang

Trong thành và trong lòng phế nang, người ta có thể phát hiện được những đại thực bào có chứa dị vật Trong bào tương của chúng thường có những giọt lipid và nhiều không bào Những đại thực bào này từ vách gian phế nang xâm nhập vào thành và lòng phế nang Đại thực bào phế nang có hình trứng, kích thước lớn, trong bào tương có những hạt bụi nên còn được gọi là những “tế bào bụi” Ở một số bệnh tim, có sự ứ máu trong phổi, các đại thực bào chứa nhiều hạt hemosiderin và sắc tố

Về nguồn gốc của những đại thực bào phế nang, cũng giống như những đại thực bào ở những nơi khác của cơ thể, có nguồn gốc từ những bạch cầu đơn nhân

Vách gian phế nang

Vách gian phế nang là một vách mỏng, nằm giữa hai phế nang cạnh nhau Vách gian phế nang được tạo thành bởi:

- Lưới mao mạch dày đặc gọi là lưới mao mạch hô hấp Đường kính

mao mạch thường lớn hơn bề dày của vách gian phế nang, nên làm cho vách phế nang có nhiều nơi lồi vào trong lòng phế nang Phía ngoài lớp nội mô của các mao mạch được bao quanh bởi màng đáy Màng này thường dính vào màng đáy của biểu mô phế nang

- Vùng trung tâm vách gian phế nang có lưới sợi võng, sợi chun Những sợi này cùng với những nhánh nối của mao mạch, đi vào thành các phế nang gần kề

- Một số ít sợi tạo keo và sợi cơ trơn

- Trong vách gian phế nang còn có một số tế bào mà số lượng nhiều hay ít tuỳ thuộc vào tuổi tác, mức độ mỏng của thành phế nang, như:

+ Những tế bào chứa mỡ có nhiều không bào trong bào tương

+ Những đại thực bào có thể lách qua biểu mô hô hấp, lọt vào lòng phế nang, ăn các hạt bụi và trở thành các tế bào bụi

Như vậy, không khí trong lòng phế nang được ngăn cách với máu trong lòng mao mạch hô hấp (nằm trong vách gian phế nang) bởi hàng rào phế nang-mao mạch (hay hàng rào khí-máu) gồm các lớp:

+ Lớp chất phủ trên mặt tế bào phế nang

+ Bào tương các tế bào biểu mô hô hấp (lợp thành phế nang)

+ Màng đáy lợp ngoài biểu mô hô hấp

+ Màng đáy lợp ngoài nội mô mao mạch hô hấp Hai màng đáy ở đây thường hoà với nhau

+ Bào tương của tế bào nội mô mao mạch

1.1.4 Màng phổi

Những khoang chứa những lá phổi được lợp bởi lớp thanh mạc gọi là màng phổi Màng phổi được tạo thành bởi một lớp mô liên kết xơ mỏng, trong đó có những tế bào sợi và đại thực bào, những bó sợi chun chạy dọc theo các hướng khác nhau và được lợp bởi một lớp trung biểu mô Phần màng lợp thành khoang ngực gọi là lá thành, còn phần màng quay lại lợp trên mặt phổi gọi là lá tạng Màng phổi có nhiều mao mạch máu và mao mạch bạch huyết Lá thành của màng phổi có ít sợi thần kinh liên quan với thần

kinh hoành và thần kinh liên sườn Ở lá tạng có những nhánh của thần kinh giao cảm và phó giao cảm Giữa lá thành và lá tạng là khoang màng phổi có chứa một lớp dịch mỏng, có thể thấy những tế bào của lớp trung biểu mô bị bong ra

1.2 PHÂN LOẠI MÔ BỆNH HỌC UTP

1.2.1 Một số phân loại mô bệnh học UTP

Phân loại mô bệnh học ung thư phổi là vấn đề rất quan trọng và cần thiết

vì ngoài chẩn đoán xác định, typ mô bệnh học còn giúp cho Bác sĩ lâm sàng tiên lượng bệnh và đưa ra phương pháp điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân Chính vì vậy đã có rất nhiều nhà bệnh học trên thế giới nghiên cứu sâu để đưa

ra một phân loại chi tiết, có tiêu chuẩn rõ ràng và dễ áp dụng và có ý nghĩa trong điều trị và tiên lượng bệnh Tuy nhiên, do tính phức tạp mặt về vi thể nên trong vòng 30 năm qua, đã có khoảng 40 bảng phân loại khác nhau được công bố trên y văn, trong đó quan trọng nhất và cũng phổ biến nhất là 3 phân loại MBH các u phổi vào các năm 1967, 1981, 1999 của TCYTTG

PHÂN LOẠI MBH CÁC UTBM PHỔI CỦA TCYTTG (1967) [63] Phân loại 1967

1 UTBM dạng biểu bì

2 UTBMTBN không biệt hoá

3 UTBM tuyến

4 UTBM tế bào lớn

1.1 U đặc với chất giống nhầy

1.2 U đặc với chất giống nhầy ở bên ngoài

7.3 Loại khác

8 U nhú của biểu mô bề mặt

9.U hỗn hợp và sacôm UTBM

10 Sacôm

11 UTBM không xếp loại

Sau 10 năm áp dụng, để bảng phân loại có tính cập nhật, TCYTTG

đã tổ chức một hội thảo quốc tế về vấn đề này vào 10-1977 ở Genève, đã tái bản cuốn sách "Phân loại mô học các u phổi" lần thứ 2 (1981), có thay đổi, sửa chữa [64]

PHÂN LOẠI MBH CÁC UTBM PHỔI CỦA TCYTTG (1981)

1 UTBM vảy (UTBM dạng biểu bì)

Ung thư tế bào hình thoi

2 UTBMTBN

UTBM tế bào lúa mạch

UTBMTBN, týp tế bào trung gian

UTBM tế bào lúa mạch tổ hợp

7 Ung thư tuyến phế quản

UTBM nang dạng tuyến

U biểu mô dạng biểu bì nhầy

Loại khác

8 Các loại khác

Phân loại mô học các u phổi lần 3 của TCYTTG có nhiều điểm khác biệt với các phân loại trước đó Riêng týp UTBMT có bổ sung thứ týp hỗn hợp và

5 biến thể WHO 1999 [65]

PHÂN LOẠI MBH CÁC UTBM PHỔI CỦA TCYTTG (1999)

Ung thư biểu mô tể bào nhỏ tổ hợp 8045/3

III Ung thư biểu mô tuyến 8140/3

+ Týp hỗn hợp nhầy và không nhày hay týp tế

bào trung gian

UTBM tuyến tế bào nhẫn 8490/3

IV UTBM tế bào lớn

Biến thể

8012/3

UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn 8013/3

UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn tổ hợp

UTBM dạng đáy 8123/3

UTBM tế bào lớn với phenotyp hình gậy 8014/3

V.UTBM tuyến vảy 8560/3

VI.UTBM với các phần tử đa hình sarcoma

VIII.UTBM tuyến nước bọt

UTBM dạng biểu bì nhầy 8430/3

UTBM nang dạng tuyến 8200/3

Các loại khác

IX.UTBM không xếp loại 8010/3

Bên cạnh các phân loại mô bệnh học về toàn bộ các u của phế quản –

phổi, cũng có những phân loại mang tính chuyên sâu về mọi nhóm hoặc một

týp u riêng biệt Dựa trên các tiến bộ về hoá mô miễn dịch, hoá miễn dịch tế

bào, siêu cấu trúc và nuôi cấy tế bào, Warren W.H và cộng sự (1985), đã đề nghị một phân loại mới về u thần kinh nội tiết của phổi như sau: [61]

- U carcinoid

- UTBM thần kinh nội tiết rất biệt hoá

- UTBM thần kinh nội tiết ít biệt hoá

- UTBM thần kinh nội tiết týp tế bào nhỏ và các týp khác của u thần kinh nội tiết bao gồm:

U cacxinoit Dạng cơ quan; Thể bè; vi

nang (giả hoa hồng); Giả tuyến; Nhú; Tế bào hình thoi; tế bào lớn ưa axit với xương và sụn

UTBM

TKNT biệt

hoá vừa

U cacxinoit không điển hình Dạng cơ quan với ổ hoại tử

Lan toả là chủ yếu

Tế bào hình thoi UTBM

TKNT không

biệt hoá

UTBMTBN Không biệt hoá UTBMTBN typ tế bào lúa mạch UTBMTBN typ tế bào trung gian UTBMTBN typ hỗn hợp tế bào nhỏ và lớn

UTBMTBN tổ hợp

Tế bào lớn TKNT

UTBMTBN thần kinh nội tiếtUTBMTBN thần kinh nội tiết hỗn hợp tế bào nhỏ/ tế bào lớn

Tế bào lớn TKNT

1.2.2 Đặc điểm MBH các phân týp và các biến thể của UTBMT của phổi

1.2.2.1 Ung thư biểu mô tuyến typ chùm nang

- Một ung thư biểu mô tuyến với các túi tuyến và ống Các tuyến này có kích thước không đều, lòng tuyến có thể có chất nhầy

- Các tế bào u lót lòng ống, tuyến là các tế bào dạng trụ, nhân lệch đáy, giống các tế bào biểu mô chế nhầy giống tế bào tuyến phế quản hay lót phế quản Nhuộm PAS có thể thấy các ổ hay dải chất nhầy ngoại bào có màu đỏ tươi

1.2.2.2 Ung thư biểu mô tuyến typ nhú

- Một ung thư biểu mô tuyến có các cấu trúc nhú chiếm ưu thế và thay thế cấu trúc phế nang nằm dưới

- Có 2 typ cấu trúc nhú: Một gồm các tế bào khối hoặc trụ thấp không chế nhầy (tế bào Clara/ các phế bào tip II) thay thế các tế bào lót phế nang và

để lộ những nhánh nhú bậc ba và bậc hai phức tạp, loại khác gồm những tế bào khối hay trụ thấp có hay không chế nhầy phát triển bằng mô đệm xơ mạch riêng và xâm lấn nhu mô phổi

1.2.2.3 Ung thư biểu mô tuyến typ tiểu phế quản- phế nang (BAC- Bronchioloalveolar carcinoma)

- Một ung thư biểu mô có một mẫu u tiểu phế quản phế nang thuần khiết và không có bằng chứng xâm nhập mô đệm mạch hay màng phổi

- Có thể bề dầy của vách phế nang tăng phần nào và có một vùng xẹp phế nang ở trung tâm hay dưới màng phổi với tăng độ chun

- Vì định nghĩa này đòi hỏi việc loại trừ một thành phần xâm nhập, loại

u này không thể chấn đoán được ở những bệnh phẩm sinh thiết nhỏ Có thể xác nhận một mẫu tiểu phế quản phế nang ở một bệnh phẩm sinh thiết nhỏ nhưng chẩn đoán cuối cùng phải thông qua việc lấy mẫu mô học ở một bệnh phẩm cắt bỏ Nếu nhận dạng được một thành phần xâm nhập thì khi ấy u được phân loại là “Ung thư biểu mô tuyến hỗn hợp, thứ typ tiểu phế quản phế nang

Ung thư biểu mô tuyến typ tiểu phế quản- phế nang không chế nhầy

- Ung thư biểu mô tiểu phế quản phế nang không chế nhầy thường cấu tạo bởi một cục phổi ngoại vi cho thấy các khoảng phế nang nhận được và các

bờ lờ mờ trên mảnh cắt Hình màng phổi răng cưa kết hợp với những ổ xơ, ổ bụi than dưới màng phổi hay ở trung tâm

- Một ung thư biểu mô tuyến không chế nhầy với các tế bào Clara và/ hoặc các phế bào typ II phát triển dọc theo vách phế nang và không có xâm lấn mô đệm

- Các tế bào Clara hình trụ hay hình chốt với các chỗ nhô ra (Snouts) của bào tương và bào tương ưa toan Một số nhân khú trú ở vùng đỉnh bào tương Có thể thấy các hạt nhỏ trong bào tương nhuộm PAS dương tính

- Tế bào typ II hình khối, hình mái vòm với những hốc nhỏ trong bào tương hoặc bào tương sáng đều có bọt Những thể vùi ưa toan trong nhân với quầng sáng có thể thấy ở một trong hai typ tế bào đó Không nhất thiết phải xác định cụ thể những tip tế bào đó trong chẩn đoán thông lệ

- Xâm lấn mô đệm được gợi ra bởi tế bào u sắp xếp thành những cấu trúc túi tuyến, nhú ống hay các ổ đặc tế bào không chế nhầy, xâm nhập vào màng phổi cũng như sự xâm lấn các bạch mạch hoặc mạch và di căn Nhuộm chất chun có thể làm nổi rõ sự xâm lấn màng phổi và mạch

Ung thư biểu mô tuyến typ tiểu phế quản- phế nang chế nhầy

- Loại u này có xu hướng lan tràn sinh khí tạo thành những u vệ tinh ở phổi U có thể hiện diện như một cục đơn độc, như nhiều cục hoặc toàn bộ một thuỳ có thể bị chắc lại do u, giống viêm phổi thuỳ (biến thể viêm phổi lan toả)

- Một ung thư biểu mô tuyến nhầy bao gồm các tế bào trụ cao với những lượng thay đổi chất nhầy trong bào tương cùng sự di chuyển điển hình nhân về đáy tế bào, phát triển dọc theo các vách phế nang và không xâm lấn

mô đệm

- Các khoảng phế nang thường căng phồng vì chất nhầy Tính không điển hình của nhân nhẹ, nhân thay đổi từ nhỏ bắt mầu sẫm tới kích thước trung bình với hạt nhân nhỏ

- Mẫu ung thư biểu mô tiểu phế quản phế nang này có thể giống ung thư biểu mô tuyến thứ phát di căn vào phổi

Ung thư biểu mô tuyến typ tiểu phế quản- phế nang chế nhầy và không chế nhầy

- Một ung thư biểu mô tuyến với sự pha trộn của các tế bào chế nhầy và không chế nhầy Tế bào u phát triển dọc theo các vách phế nang, không có xâm lấn mô đệm

- Các ung thư biểu mô hỗn hợp chế nhầy và không chế nhầy tiểu phế quản phế nang rất hiếm

1.2.2.4 Ung thư biểu mô tuyến đặc có chất nhầy

- Một ung thư biểu mô tuyến không có các túi tuyến, ống nhỏ và nhú, nhưng thường xuyên có tế bào u chứa chất nhầy (5 hay nhiều hơn nữa tế bào dương tính với chất nhầy trong ít nhất 2 vi trường ở bội số lớn)

- Cần phân biệt với ung thư biểu mô tế bào lớn bằng cách nhuộm chất nhầy (PAS hoặc mucicarmin với men thủy phân glycogen) Trong ung thư biểu mô tế bào lớn không có chất nhày hoặc lượng chát nhầy là rất nhỏ

1.2.2.5 Ung thư biểu mô tuyến với các thứ typ hỗn hợp

- Đa số ung thư biểu mô tuyến cho thấy có pha trộn những thứ typ mô học nêu trên

- Ví dụ, các ung thư biểu mô tuyến có mẫu tiểu phế quản phế nang nổi trội và có một thành phần xâm nhập phải được gọi là ung thư biểu mô tuyến được pha trộn tiểu phế quản phế nang và chùm nang (hay bất kỳ mẫu nào khác khi nhận dạng) Khi đó chúng được xếp vào thứ typ hỗn hợp

1.3 CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA EGFR

1.3.1 Cấu trúc của EGFR

EGFR là một glycoprotein bề mặt màng, trọng lượng phân tử 170 kDaltons, (kDa), gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào, một vùng xuyên màng đặc hiệu và một vùng trong tế bào với vai trò kích thích sự tăng sinh, biệt hoá của tế vào bình thường và các tế bào ác tính [14] Khi phối tử là yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth Factor: EGF) gắn với EGFR sẽ gây nên sự phân cực thụ thể và sự tự phosphoryl hoá vùng có hoạt tính enzym của thụ thể Điều này khởi đầu cho một loạt phản ứng tế bào dẫn đến sự tăng sinh và tiến triển ác tính của khối u: tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình (apotosis)[54] Các phối tử của EGFR là gia đình protein EGF gồm tám thành viên bao gồm Epidermal growth factor (EGF), Transformin growth factor (TGFα), Epiregulins (ER), heparin binding EGF like growth factor (HB – EGF), Epigen (EPGN, EPG), Amphiregulin (AR), Betacellulin (BTC) và Neuregulins 1-4 EGF là chuỗi đơn acid polypeptid có 53 acid amin có chứa ba liên kết disulfua nội phân tử để đảm bảo cấu trúc bậc ba của phân tử EGF Đặc tính quan trọng của EGF

chính là truyền vào trong tế bào các tín hiệu từ ngoài tế bào thông qua việc kết nối với các EGFR

Phần ngoài màng của EGFR có trọng lượng khoảng 100 kDa có hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử EGF Vùng xuyên màng trọng lượng nhỏ, chỉ 3 kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng Phần trong tế bào trọng lượng khoảng 60 kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hoá của EGFR Cấu trúc phần ngoài màng của các thành viên trong gia đình EGFR giống nhau khoảng từ 36 – 40%, phần xuyên màng khoảng 60 – 82%, trong khi phần trong màng của các thành viên gia đình EGFR chỉ giống nhau khoảng 24-32%

Có 4 thành viên trong gia đình EGFR: HER1 (EGFr, ErbB1), HER2 (neu, ErbB2), HER3 (ErbB3), và HER4 (ErbB4) ErbB receptor ở dạng cặp đôi với chính nó hay với ErbB khác (ErbB2) khi gắn kết với các phối tử EGF, chúng hoạt hoá phần trong bào tương của EGFR, mang các gốc phosphat của tyrosin kinase bằng các phản ứng tự phosphoryl hoá Phần tyrosin kinase này được hoạt hoá, kết quả làm phân cực để lộ các gốc phosphat, bằng cách đó làm tăng hoạt tính vùng tyrosin kinase của EGFR Phản ứng tự phosphoryl hoá để lộ những vị trí gắn kết với các protein tín hiệu trong để bào và hoạt hoá các con đường tín hiệu ErbB1 thành viên đầu tiên của EGFR, tăng biểu

lộ ở nhiều dòng tế bào biểu mô cả bình thường và ác tính Chỉ riêng EGFr được hoạt hoá khi gắn kết với EGF hoặc TGFα [45]

Hình 1.1 Các dạng cặp đôi EGFR và sự gắn kết các phối tử

(Theo New Medicin's Oncology Knowledge BASE, Tagets in Oncology Module, February 2007)

1.3.2 Chức năng của EGFR

Các EGFR đều có phần để liên kết ngoài màng, phần xuyên màng và phần trong bào tương có hoạt tính tyrosin kinase Phần ngoài màng, vùng III (domain III) chính là cùng để gắn kết các yếu tố hoạt hoá hay ức chế các thụ thể, để dẫn truyền tín hiệu vào trong tế bào làm tế bào có thể phát triển bình thường hoặc trở nên ác tính Vùng IV chính là phần xuyên màng của EGFR Phần trong bào tương, đầu tận carboxy chính là phần đáp ứng trả lời hoạt tính tyrosin kinase và điều hoà chức năng tyrosin kinase Phản ứng tự phosphoryl hoá của tyrosin kinase xảy ra ở vùng này nó đóng vai trò chính trong điều hoà

sự phát triển tăng sinh của tế bào Khi vắng mặt các phối tử (ví dụ GF, TGF…), vùng tyrosin kinase không phosphoryl hoá, chúng ở dạng đơn phân

và vùng kinase không hoạt động Vùng tyrosin kinase trở nên hoạt hoá khi phối tử gắn với vùng ngoại bào kết quả làm phân cực để lộ các gốc phosphat

và tự phosphoryl hoá tyrosin điều hoá trong vòng hoạt hoá của kinase Sau khi hoạt hoá, việc tự phosphoryl hoá để lộ những vị trí gắn kết các protein tín hiệu và hoạt hoá các con đường tín hiệu [13, 16]

(Theo New Medicin's Oncology Knowledge BASE, Tagets in Oncology Module, February 2007)

Hình 1.2 Cấu trúc các vùng chính của EGFR

Các đột biến phầm ngoài màng EGFRvIII được nghiên cứu nhiều nhất vì chính sự đột biến của vùng này làm cho không có sự gắn các phối tử truyền tín hiệu vào trong nhân thông qua các EGFR Sự tăng biểu hiện EGFRvIII hay gặp trong các khối u ác tính của hệ thống thần kinh, ung thư vú, ung thư buồng trứng Đột biến xảy ra là kết quả của sự sắp xếp lại gen sao chép bị đột biến từ exon 2-7 gồm 801bp Các thụ thể này thiếu từ acid amin 6-273, hoàn toàn thiếu hụt ở phần ngoài tế bào của EGFR và đây cũng là phần chính của EGFR để liên kết với các phối tử Tại vùng này các glycin luân phiên kết nối với nhau chèn vào các vị trí của acid amin cấu trúc EGFR, chính vì thế mà không xảy ra sự sao chép từ acid amin -273 EGFRvIII khác EGFRvI ở chỗ, EGFRvI làm thay đổi liên kết của thụ thể với các phối tử còn EGFRvIII làm vùng liên kết với phối tử bị mất hoàn toàn Chính vì vậy EGFRvIII kích thích tăng sinh và tăng phát triển khối u ác tính không phụ thuộc tương tác của các phối tử Phản ứng tự phosphoryl của thụ thể TK ở EGFRvIII thấp hơn EGFR thể tự nhiên (wildtypEGFR: wtEGFR) Vì thế, hoạt tính các phối tử TK trong

tế bào của EGFRvIII khác khi so với hoạt tính các phối tử wtEGFR

EGFRvIII bền vững và hiện diện trên bề mặt tế bào hơn là phần trong tế bào của thụ thể

Đột biến cấu trúc phần trong bào tương EGFR ít thấy hơn vùng cấu trúc phần ngoài màng Chưa có nghiên cứu nào thấy sự đột biến xảy ra tại vùng có hoạt tính tyrosin kinase trong tế bào của thụ thể EGF [47]

1.4 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN EGFR

1.4.1 Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (HMMD)

Kỹ thuật HMMD đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới Đây là bước

đột phá trong nghiên cứu bệnh học phân tử góp phần định tính hoặc bán định lượng các phân tử kháng nguyên Kỹ thuật này là phương pháp áp dụng các nguyên lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiên cứu tế bào và mô Dựa trên sự biểu

lộ mang tính đặc hiệu kháng nguyên trên bề mặt tế bào hay tại khu vực gian bào, các kháng thể đặc hiệu sẽ giúp cho việc nhận ra và phân loại các tế bào hay mô trên các lát cắt tổ chức

- Các KN có thể hiện diện ở trong bào tương, màng hoặc nhân tế bào KT chủ yếu là IgG KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất, có hai loại:

+ KT đa dòng: chứa nhiều KT khác phản ứng với nhiều quyết định KN khác + KT đơn dòng: chỉ chứa một loại quyết định KN Nhược điểm của loại

KT này là có phản ứng chéo với các quyết định KN tương tự trên một KN không liên quan

Vì phức hợp KN-KT không thể thấy được dưới KHVQH nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng KN-KT, gồm hai phần:

- KT thứ hai: là cầu nối KT thứ nhất với hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết là kháng KT thứ nhất KT thứ hai được gắn với Biotin trong phương pháp ABC

- Hệ thống phúng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men, chất nền và chất màu Trong phương phỏp ABC, men được gắn với KT bằng một phần cầu nối hoỏ học (Avidin và Biotin) Với một chất nền thớch hợp với men và chất màu được gắn lờn để cho phộp xỏc định sự hiện diện của KN trong mụ dưới KHVQH Cú nhiều phương phỏp để hiển thị phản ứng KN-KT, song phương phỏp ABC ở trờn được sử dụng nhiều vỡ cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vỡ Avidin cú ỏi lực mạnh với Biotin và men Peroxidase, làm cầu nối cho men gắn vào Biotin (trờn KT thứ hai) Một phõn tử Avidin cú 4 vị trớ gắn men Peroxidase nờn hệ thống nhận biết được phúng đại lờn gấp 4 lần

Phương phỏp sử dụng phức hợp avidin – biotin được hầu hết cỏc phũng xột nghiệm hoỏ miễn dịch sử dụng trong nghiờn cứu tế bào và mụ Với kỹ thuật này, ỏi lực cao của avidin đối với biotin được sử dụng để gắn chất đỏnh dấu peroxidase

Cỏc bước cơ bản của kỹ thuật miễn dịch enzym

Biotin – avidin

Bộ c lộ – Kết hợp – K h u yếc h đại

Kháng thể II gắn biotin Kháng thể I Kháng nguy ên

Biotin Avidin

M en

Bệnh phẩm đ−ợc cố định form ol

1.4.2 Kỹ thuật sinh học phân tử [dẫn theo 5]

Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp: Đây là phương pháp thường được

sử dụng khi mật độ tế bào ung thư trong mô phân tích ≥ 30% Với tỷ lệ này, việc các định đột biến gen bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp có độ nhạy

và độ đặc hiệu lên đến 99% DNA của bệnh nhân tách chiết từ mẫu mô được

sử dụng để khuếch đại gen EGFR, KRAS và BRAF bằng phản ứng RCR sử

dụng các cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào giải trình tự trực tiếp sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing

(Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen được đối chiếu với trình

tự của gen EGFR, KRAS, BRAF hoang dại trên Genbank (National center for biotechnology information, NCBI) và phân tích theo phương pháp ABI Prism

310 genetic analyzer (Applied Biosystems)

Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)

Phương pháp phát hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên nguyên lý: exon 21 của gen EGFR kiểu dại có vùng trình tự đặc hiệu cho enzyme Mscl, đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trí cắt của enzyme

do đó sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzyme Mscl Tương tự, trình tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gen KRAS có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị trí cắt của enzyme BstNI Với kỹ thuật này thì sản phẩm PCR khuếch đại các exon 18-21 gen EGFR và exon 2 gen KRAS được phân cắt bởi enzyme Mscl hoặc enzyme BstNI Sản phẩm cắt bằng enzyme được điện di phân tích trên gel agarose NuSieve GTG nồng

độ 3% sẽ xác định được đột biến điển hình trên gen EGFR và KRAS Đây là phương pháp truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao trong trường hợp xác định đột biến điển hình Phương pháp này hứa hẹn khả năng áp dụng rộng rãi trong việc sàng lọc nhanh các đột biến tại exon

21 của gen EGFR và đột biến tại codon 12 của gen DRAS một cách hiệu quả