* Kỹ thuật nhuộm hoỏ mụ miễn dịch để phỏt hiện bộc lộ quỏ mức EGFR được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện TW Quõn đội 108.
Nhuộm hoỏ mụ miễn dịch theo phương phỏp miễn dịch peroxidase trờn cỏc tiờu bản chuyển đỳc paraffin. Sử dụng cỏc khỏng thể và hoỏ chất của hóng Dako.
Bộ c lộ Bộ c lộ –– K ết h ợp K ết h ợp –– K h u y ếc h K h u yếc h đ ạ iđ ạ i Kh Khááng thể ng thể IIII gắn biotin gắn biotin Kh Khááng thể ng thể II Kh
Khááng nguyng nguyênên
Biotin Biotin Avidin Avidin M en M en Bệnh phẩm Bệnh phẩm đđ−−ợc cố ợc cố đđịnh form olịnh form ol
- Sửa soạn tiờu bản vựi nến
+ Cắt mỏng mẫu mụ 3-5 àm và đặt vào lam sạch cú trỏng silan. + Ủ tiờu bản ở nhiệt độ 56ºC trong 1-2 giờ trước khi nhuộm - Khỏng thể được sử dụng.
+ Khỏng thể EGFR clone DAK -H1 -WT là khỏng thể đơn dũng pha sẵn của hóng Dako.
- Nhuộm hoỏ mụ miễn dịch với EGFR
+ Tiờu bản sau khi tẩy paraffin được nhỳng vào nước cất 2 lần x 5 phỳt. + Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 3% 5 phỳt
+ Rửa tiờu bản bằng dung dịch Tris Buffer Saline (TBS) pH 7,6 x 5 phỳt khử protein khong đặc hiệu bằng Bovine Serum Albumine 5phỳt
+ Rửa tiờu bản bằng dung dịch (TBS) hai lần 5 phỳt, khụng để khụ tiờu bản + Phủ khỏng thể khỏng nguyờn 60 phỳt
+ Rửa tiờu bản bằng dung dịch (TBS) hai lần 5 phỳt + Phủ khỏng thể 2 Biotin hoỏ 30 phỳt
+ Rửa tiờu bản bằng dung dịch (TBS) hai lần 5 phỳt + Phủ phức hợp Avidin Biotine (ABC) 30 phỳt + Rửa tiờu bản bằng dung dịch (TBS) hai lần 5 phỳt + Phủ dung dịch Diamino Benzidine (DAB) 10 phỳt. + Rửa nước chảy 5 phỳt
+ Nhuộm tương phản với Hematoxylin 5 giõy
+ Khử nước, làm sạch tiờu bản, gắn lỏ kớnh rồi đọc kết quả trờn kớnh hiển vi quang học.
Đỏnh giỏ EGFR trờn UTBMT phổi:
Sử dụng mụ phổi lành cạnh u làm chứng õm, sử dụng mụ u đó chắc chắn là dương tớnh làm chứng dương.
Theo hóng Dako, dựa vào tỷ lệ % tế bào u bắt màu trờn màng bào tương và cường độ bắt màu (ở độ phúng đại x 200 ):
0: Khụng bắt màu trờn màng bào tương hoặc bắt màu trong bào tương.
1(+): Màng bào tương bắt màu nhạt < 10% tế bào u, bắt màu một phần màng bào tương.
2(+): Màng bào tương bắt màu trung bỡnh >10% tế bào u, bắt màu hoàn toàn hoặc một phần màng bào tương.
3(+): Màng bào tương bắt màu đậm > 10% tế bào u, bắt màu hoàn toàn màng bào tương tạo hỡnh ảnh mạng lưới.
Kết quả ở mức 2+ và 3+ mới được coi là dương tớnh.