Kỹ thuật giải trỡnh tự gen trực tiếp: Đõy là phương phỏp thường được sử dụng khi mật độ tế bào ung thư trong mụ phõn tớch ≥ 30%. Với tỷ lệ này, việc cỏc định đột biến gen bằng phương phỏp giải trỡnh tự trực tiếp cú độ nhạy và độ đặc hiệu lờn đến 99%. DNA của bệnh nhõn tỏch chiết từ mẫu mụ được sử dụng để khuếch đại gen EGFR, KRAS và BRAF bằng phản ứng RCR sử dụng cỏc cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào giải trỡnh tự trực tiếp sử dụng phương phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trỡnh tự gen được đối chiếu với trỡnh tự của gen EGFR, KRAS, BRAF hoang dại trờn Genbank (National center for
biotechnology information, NCBI) và phõn tớch theo phương phỏp ABI Prism
310 genetic analyzer (Applied Biosystems).
Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)
Phương phỏp phỏt hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trờn nguyờn lý: exon 21 của gen EGFR kiểu dại cú vựng trỡnh tự đặc hiệu cho enzyme Mscl, đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trớ cắt của enzyme do đú sản phẩm PCR khụng bị cắt bởi enzyme Mscl. Tương tự, trỡnh tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gen KRAS cú vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị trớ cắt của enzyme BstNI. Với kỹ thuật này thỡ sản phẩm PCR khuếch đại cỏc exon 18-21 gen EGFR và exon 2 gen KRAS được phõn cắt bởi enzyme Mscl hoặc enzyme BstNI. Sản phẩm cắt bằng enzyme được điện di phõn tớch trờn gel agarose NuSieve GTG nồng độ 3% sẽ xỏc định được đột biến điển hỡnh trờn gen EGFR và KRAS. Đõy là phương phỏp truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao trong trường hợp xỏc định đột biến điển hỡnh. Phương phỏp này hứa hẹn khả năng ỏp dụng rộng rói trong việc sàng lọc nhanh cỏc đột biến tại exon 21 của gen EGFR và đột biến tại codon 12 của gen DRAS một cỏch hiệu quả.
Kỹ thuật Scorpions-Amplification Re-farctory Mutaiton System (Scorpions ARMS).
Hiện nay, nhiều kỹ thuật sinh học phõn tử được ứng dụng nhằm phỏt hiện
đột biết gen EGFR, KRAS, BRAF. Tuy nhiờn chỉ một vài kỹ thuật được cỏc
cơ quan quản lý Y Dược của Chõu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phộp cụng nhận
đạt tiờu chuẩn ứng dụng trong chẩn đoỏn lõm sang. Kỹ thuật Scorpions
ARMS là một trong số ớt những kỹ thuật đú (European Union in vitro
Diagnostic Medical Device Directive 98/79/EC). Scorpions ARMS là sự kết
hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và cụng nghệ Scorpions trong phản ứng Real time PCR để phỏt hiện cỏc đột biến. Trong đú, nguyờn lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tớnh của Taq DNA polymerase chỉ khếch đại hoàn chỉnh 1 phõn tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuụn bổ xung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi khụng bổ xung với sợi khuụn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trờn nguyờn lý này, kỹ thuật cho phộp khuếch đại đặc hiệu một trỡnh tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đú chiếm 1 tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuụn DNA. Scor-pions là phõn tử cú cấu tạo một đầu mang trỡnh tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trỡnh tự này được nối với một đầu dũ. Fluorophore phỏt tớn hiệu huỳnh quang của đầu dũ được gắn với quencher cú nhiệm vụ dập tắt tớn hiệu huỳnh quang của fluorophore. Trong phản ứng PCR khi đầu dũ bỏm với đoạn trỡnh tự khuếch đại, Fluoro- phore được giải phúng khỏi quencher, phỏt tớn hiệu đến cảm biến của mỏy Realtime-PCR.
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp).
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) là cụng nghệ mới nhất được phỏt triển bởi cỏc nhà khoa học tại viện cụng nghệ RIKEN – Nhật Bản nhằm phỏt hiện cỏc đột biến trờn gen EGFR và KRAS. Nguyờn lý cơ bản
của kỹ thuật SmartAmp là: Khuếch đại DNA = Phỏt hiện đột biến. Để thực hiện được nguyờn lý này kỹ thuật SmartAmp sử dụng: I) cỏc cặp mồi phỏt hiện đột biến được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu cỏc khả năng mồi ghộp cặp sai với sợi khuụn; II) một loại protein mới với khả năng nhận biết và bỏm đặc hiệu tại vị trớ cú sự ghộp cặp khụng tương đồng giữa mồi và khuụn (TaqMutS) ngăn khụng cho phức hợp mồi khuụn được khuếch đại trong phản ứng kộo dài chuỗi. Chỉ những phức hợp mồi – khuụn DNA ghộp cặp hoàn mới được khuếch đại nhờ DNA polymerase, tớn hiệu của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phỏt hiện trong hệ thống mỏy Realtime-PCR. Thực tế cho thấy một trong những khú khăn của việc ỏp dụng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử như giải trỡnh tự, Scorpions ARMS trong thực tế lõm sang thường đũi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viờn cú kiến thức chuyờn sõu về sinh học phõn tử, giỏ thành cao, thời gian phõn tớch kết quả lõu. Cỏc cụng trỡnh nghiờn ỏp dụng kỹ thuật SmartAmp cho thấy kỹ thuật vận hành qua 1 bước duy nhất “khuếch đại DNA = phỏt hiện đột biến”, cú độ chớnh xỏc cao, thời gian từ khõu tỏch mẫu đến cho kết quả phõn tớch đột biến gen rất ngắn: ∼ 30 phỳt. Đõy là một ưu thế nổi bật của kỹ thuật SmartAmp so với cỏc kỹ thuật khỏc như giải trỡnh tự gen (1-2 ngày), PCR-RFLP (1-2 ngày), Scorpions ARMS (3-4 tiếng). Một khi kỹ thuật SmartAmp được ỏp dụng thành cụng, kỹ thuật mới này sẽ là một cụng cụ đắc lực giỳp cỏc nhà y sinh học và cỏc bỏc sĩ lõm sang Việt Nam hiện thực húa mục tiờu y học: Điều trị bệnh theo thực trạng bộ gen của cỏ thể.